第四节 染色体
染色体是细胞在有丝分裂(或减数分裂)时遗传物质存在的特定形式，是间期细胞染色质结构紧密组装的结果。不同生物的细胞中含有不同数目的染色体(表9-6)。所有单倍染色体组包含的DNA组成该生物基因组。
一、染色体的形态结构
中期染色体具有比较稳定的形态，它由两条相同的姐妹染色单体( (chromatid))构成，彼此以着丝粒( centromere)相连。根据着丝粒在染色体上所处的位置，可将中期染色体分为4种类型(图9-23，表9-7)：中着丝粒染色体( metacentric chromosome)，两臂长度相等或大致相等；亚中着丝粒染色体( submetacentric chromosome)；亚端着丝粒染色体( subtelocentric chrom-some)，具有微小短臂；端着丝粒染色体( telocentric chromosome
染色体各部的主要结构如下
(一)着丝粒与动粒
着丝粒连接两条染色单体，并将染色单体分为两臂：短臂(p)和长臂(q)。由于着丝粒区浅染内缢，所以也叫主缢痕( primary constriction)。近年来的研究表明，着丝粒是一种高度有序的整合结构，在结构和组成上都是非均一的，至少包括三种不同的结构域：
(1)沿着着丝粒外表面的动粒结构域( kinetochore domain)哺乳类动粒(又称着丝点， kinetochore)超微结构可分为三个区域(图9-24)：一是与着丝粒中央结构域相联系的内板( (inner plate))；二是中间间隙( middle space)，电子密度低，呈半透明区；三是外板( outer plate)。在没有动粒微管结合时，覆盖在外板上的第4个区称为纤维冠( fibrouscorona)，由微管蛋白构成。动粒微管与内外板相连，并沿纤维冠相互作用，与内板相联系的染色质是与微管相互作用的位点。已有证据表明，动粒结构域的化学组成包括与动粒结构与功能相关的两类蛋白质以及着丝粒DNA，但是目前关于动粒的结构模型尚无定论。
(2)中央结构域( (central domain)这是着丝粒区的主体，由串联重复的卫星DNA组成。这些重复序列大部分是物种专一的。人染色体的着丝粒DNA由卫星DNA组成，重复单位17bp，每一着丝粒串联重复2000~30000次可达250kb至400kb，但不同染色体着丝粒的α卫星DNA序列存在差别。其中一个亚类含有17bp的DNA模式(5'-CTTCGTTGGAAACGGGA-3)，能与动粒蛋白CENP-B结合，这一DNA模式被称为CENP-B框。通过免疫印迹分析，在哺乳类染色体着丝粒区已发现CENP-A、B、C、E和F五种动粒蛋白，这些动粒蛋白和细胞分裂及其调控有密切关系，因而也是极为保守的。
(3)配对结构域( (pairing domain)位于着丝粒内
表面的配对结构域。代表中期姐妹染色单体相互作用的位点。已经发现有两类蛋白：一类是内部着丝粒蛋白 INCENP (inner centromere protein) 另一类是染色单体连接蛋白CLs( chromatid linking protein)，两者与染色单体配对有关。
虽然三种结构域具有不同的功能，但它们并不能独自发挥作用。正是三种结构域的整合功能，才确保细胞在有丝分裂中染色体与纺锤体整合，发生有序的染色体分离。
(二)次缢痕
除主缢痕外，染色体上其他的浅染缢缩部位称次缢痕( secondary constriction)。它的数目、位置和大小是某些染色体所特有的形态特征，因此也可以作为鉴定染色体的标记。
(三)核仁组织区
核仁组织区( (nucleolar organizing region，nor)位于染色体的次缢痕部位，但并非所有次缢痕都是NOR。染色体NOR是rRNA基因所在部位(5 SS TRNA基因除外)，与间期细胞核仁形成有关。
(四)随体
随体( (satellite))指位于染色体末端的球形染色体节段，通过次缢痕区与染色体主体部分相连。它是识别染色体的重要形态特征之一，有随体的染色体称为sat染色体。
(五)端粒
端粒( (telomere)是染色体两个端部特化结构。端粒通常由富含鸟嘌呤核苷酸(G)的短的串联重复序列DNA组成( TEL DNA)，伸展到染色体的3端。一个基因组内的所有端粒都是由相同的重复序列组成，但不同物种的端粒的重复序列是不同的(表9-8)。哺乳类和其他脊椎动物端粒的重复序列中的保守序列是 TTAGGG，串联重复500~3000次，序列长度在2kb到20kb之间不等。端粒的长度与细胞及生物个体的寿命有关。端粒的生物学作用在于维持染色体的完整性和独立性，可能还与染色体在核内的空间排布等有关。
二、染色体的功能元件
在细胞世代中确保染色体的复制和稳定遗传，染色体起码应具备三种功能元件( functional element)(图9-25)：至少一个DNA复制起点，确保染色体在细胞周期中能够自我复制，维持染色体在细胞世代传递中的连续性；一个着丝粒，使细胞分裂时已完成复制的染色体能平均分配到子细胞中；最后，在染色体的两个末端必须有端粒，保持染色体的独立性和稳定性。构成染色体DNA的这三种关键序列( key sequence)称为染色体DNA的功能元件。近年来采用分子克隆技术把真核细胞染色体的复制起点、着丝粒和端粒这三种DNA关键序列分别克隆成功，并把它们互相搭配或改造而构成所谓“人造微小染色体”( (artificial minichromosome)。
(一)自主复制DNA序列
应用DNA重组技术，将带有正常酵母亮氨酸合成酶的Leu基因的DNA限制酶片段重组到大肠杆菌的质粒中。用这种重组质粒去转化亮氨酸合成代谢缺陷型酵母细胞，发现单纯质粒不能转化酵母细胞，而重组质粒能在酵母细胞中复制、表达和遗传。可见该酵母DNA插入片段除含有Leu的基因外，还含有一段酵母染色体自主复制DNA序列( ( autonomously replicating DNA sequence，as)。该序列首先在酵母基因组DNA序列中发现，它能使含有这一序列的重组质粒高效转化酵母细胞，并能在酵母中独立于宿主染色体而存在。根据不同来源的ARS的DNA序列分析，发现它们都具有一段11~14bp的同源性很高的富含AT的共有序列 (consensus sequence)，同时证明这段共有序列及其上下游各200bp左右的区域是维持ARS功能所必需的。现在已利用双向电泳定位复制起点的技术，直接证明了ARS在质粒以及酵母染色体上与复制起点( (replication ongin)共定位的现象。绝大多数真核细胞的染色体含有多个复制起点，以确保全染色体快速复制。现在还没有确定真核生物的复制起点的DNA序列是否具有固定模式，但大多包含一个富含AT的序列。
(二)着丝粒DNA序列
上述插入ARS的重组质粒，虽然能在酵母细胞中复制和表达，但由于它缺少着丝粒，因此不能在酵母细胞有丝分裂时平均分配到子细胞中去。当把酵母染色体上的着丝粒DNA序列( centromere DNA sequence，CEN)插入到这个含ARS的重组质粒中，这种新的插有酵母染色体的ARS和CEN序列的重组质粒，在有丝分裂中便表现出与正常染色体相似的复制与分离行为。根据不同来源的CEN序列分析，发现它们的共同特点是有两个彼此相邻的核心区，一个是80~90bp的AT区，另一个是11bp的保守区。通过CEN缺失损伤试验或插入突变试验，发现一旦伤及这两个核心区序列，CEN即丧失其生物学功能。
(三)端粒DNA序列
将插入ARS和CEN序列的环状重组质粒DNA在单一位点切开，形成一个具有两个游离端的线性DNA分子。虽然这段线性DNA可以在酵母细胞中复制并附着到有丝分裂的纺锤体上，但最终将从子细胞中丢失，结果细胞无法生长。如果在切开的线性DNA两端加上端粒DN序列( (telomere DNA sequence，TEL)，则转染细胞生长。这是因为环状DNA变成线性DNA分子以后无法解决“末端复制问题”，即新合成的DNA链5末端RNA引物被切除后变短的问题。真核细胞染色体端粒的重复序列不是染色体DNA复制时连续合成的，而是由端粒酶( telomerase)合成后添加到染色体末端。端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，具有反转录酶的性质，由物种特异的内在RNA作模板，把合成的端粒重复序列再加到染色体的3端(图9-26)。人的生殖细胞染色体末端比体细胞染色体末端长几千个碱基对，这是因为迄今为止只发现在生殖细胞和部分干细胞里有端粒酶活性，而在所有体细胞里则尚未发现端粒酶的活性端粒起到细胞分裂计时器的作用。不管是体内还是体外，体细胞每分裂一次，端粒重复序列就缩短一些。表明端粒重复序列的长度与细胞分裂次数和细胞的衰老有关。肿瘤细胞具有表达端粒酶活性的能力，使癌细胞得以无限制地增殖。
除了端粒酶能维持端粒的长度外，另外一个端粒变长的途径是ALT( (alternative lengthening of telomere)，这一途径不依赖于端粒酶的存在。3端突出的端粒DNA最终与5~10kb之外的另一条链上的 TTAGG同源序列配对形成一个D形环(或T形环)，以稳定端粒末端结构。这一过程由TRF2催化完成。
三、染色体带型
核型( karyotype)一词首先由苏联学者G.. Levitsky等人在20世纪20年代提出。核型分析的发展有三项技术起了很重要的促进作用：一是1952年美籍华人细胞学家徐道觉发现的低渗处理技术，使中期细胞的染色体分散良好，便于观察；二是秋水仙素的应用便于富集中期细胞分裂相；三是植物凝集素(PHA)刺激血淋巴细胞转化、分裂，使以血培养方法观察动物及人的染色体成为可能。
核型是指染色体组在有丝分裂中期的表型，是染色体数目、大小、形态特征的总和。核型分析是在对染色体进行测量计算的基础上，进行分组、排队、配对并进行形态分析的过程。核型分析对于探讨人类遗传病的机制、物种亲缘关系、远缘杂种的鉴定等都有重要意义。将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来再按长短、形态等特征排列起来的图像称为核型模式图 (idiogram)，它代表该物种的核型模式(图9-27)。
在染色体显带技术发展之前，核型分析主要是根据染色体形态和着丝粒位置的差别来进行的，因此有时对染色体仍不易精确识别和区分。1968年由瑞典细胞学家 Casperson首先建立的染色体Q带技术及其以后的发展，为核型研究提供了有力的工具。Q带技术即喹吖因( Quinacrine)荧光染色技术，显示中期染色体经氮芥喹吖因或双盐酸喹吖因染色以后，在紫外线照射下所呈现的荧光亮带和暗带。一般富含AT碱基的DNA区段表现为亮带，富含GC碱基的DNA区段表现为暗带。G带即吉姆萨( Giemsa)带，是将中期染色体制片经胰酶或碱、热、尿素、去垢剂等处理后再用吉姆萨染料染色后所呈现的染色体区带。一般来说，G带与Q带相符，但也有例外，如Q带显示的人Y染色体的特异荧光，在G带带型上并不出现。R带是指中期染色体经磷酸盐缓冲液保温处理，以吖啶橙或吉姆萨染色，结果所显示的带型和G带明暗相间带型正好相反，所以又称
反带( ( reverse band)。C带主要显示着丝粒结构异染色质及其他染色体区段的异染色质部分。T带又称末端带( terminal band)，是染色体端粒部位经吖啶橙染色后所呈现的区带，在分析染色体末端结构畸变时有用。N带又称Ag-As染色带，主要用于染核仁组织者区的酸性蛋白质。1975年以来，美国细胞遗传学家 J. J. Yunis s等建立了染色体高分辨显带技术，用氨甲蝶呤使培养的细胞同步化后，再用秋水仙胺短暂处理，获得大量晚前期和早中期分裂相，这些时期的染色体比典型中期染色体长，显带后可得到更多更细的带纹。如在人体细胞晚前期染色体组中可以分辨出843~1256条带，而中期染色体只能观察到320~550条带，因而更有助于发现细微的染色体异常。
染色体显带技术最重要的应用就是明确鉴别一个核型中的任何一条染色体，乃至某一个易位片段。同时显带技术也用于染色体基因定位和染色体重构，如染色体着丝粒的罗伯逊式融合( (Robertsonian fusion)与染色体着丝粒的罗伯逊式裂解( Robertsonian fission)
从果蝇到人，有丝分裂的染色体普遍存在特殊的带型。一个物种某一条染色体上的标准带型是非常稳定的并是特征性的。这就提示，染色体带作为更大范围的结构域对细胞的功能可能是重要的。有人估计，即使最细的带纹也应含有30个或更多的环状结构域，并且已知富含AT的带和富含GC的带都含有基因。近年来发展的显带染色体显微切割和分子微克隆技术，已有可能研究染色体某几个带纹的DNA性质，这是联系细胞遗传学与分子遗传学之间的重要桥梁。
四、特殊染色体
四、特殊染色体
在某些生物的细胞中，特别是在发育的某些阶段，可以观察到一些特殊的体积很大的染色体，包括多线染色体( polytene chromosome)和灯刷染色体( lampbrush chromosome)，这两种染色体总称为巨大染色体( giant chromosome)
(一)多线染色体
多线染色体是1881年由意大利细胞学家E.G. Balbiani首先在双翅目摇蚊幼虫的唾腺细胞中发现的，它也存在于双翅目昆虫的幼虫组织细胞内，如唾腺、气管、肠和马氏管( Malpighian tube)。此外，在不同植物的不同类型的细胞中，如胚珠细胞(胚乳、胚柄和反足细胞)也发现多线染色体多线染色体来源于核内有丝分裂( (endomitosis)，
即核内DNA多次复制而细胞不分裂。产生的子染色体并行排列，且体细胞内同源染色体配对，紧密结合在一起从而阻止染色质纤维进一步聚缩，形成体积很大的多线染色体。多线化的细胞处于永久间期，并且体积也相应增大。同种生物的不同组织以及不同生物的同种组织的多线化程度各不相同。在果蝇唾腺细胞中，染色体进行10次DNA复制，因而形成2=1024条同源DNA拷贝，形成的多线染色体比同种有丝分裂染色体长200倍以上，4条配对的染色体全长可达2mm。配对染色体的着丝粒部位结合在一起形成染色中心(图9-28)。
早期遗传学分析认为，果蝇多线染色体一条带代表一个基因，一个基因编码一种基本蛋白质。B.bosy等(1984)在果蝇基因组中克隆出一段315kb的连续DNA序列，以该DNA为探针检测该区段DNA所转录的mRNA，结果发现mRNA的种类是被鉴定带数目的3倍。所以把每条带看做一个特异的基因组区更为恰当。最近的研究表明，多线染色体的带和间带都含有基因，有可能“持家”基因( housekeeping gene)位于间带，而有细胞类型特异性的“奢侈”基因( (luxury gene)位于带上。
(二)灯刷染色体
灯刷染色体在1882年由 Flemming在研究美西螈卵巢切片时首次报道，但由于其形态特殊而未能肯定。1892年， J Rickert研究鲨鱼卵母细胞时，给灯刷染色体以正式命名。现已知道，灯刷染色体几乎普遍存在于动物界的卵母细胞中，其中两栖类卵母细胞的灯刷染色体最典型，也研究得最深入。在植物界，也有关于灯刷染色体的报道。如垂花葱( Allium cernuum)和玉米雄性配子减数分裂中出现不很典型的灯刷染色体，而大型的单细胞藻类地中海伞藻( Acetabularia mediterranea)却有典型的灯刷染色体。
灯刷染色体是卵母细胞进行减数分裂第一次分裂时停留在双线期的染色体。它是一个二价体，包含4条染色单体。此时同源染色体尚未完全解除联会，因此可见到几处交叉。这一状态在卵母细胞中可维持数月或数年之久。
灯刷染色体轴由染色粒轴丝构成，每条染色体轴长约400μm(多数有丝分裂染色体小于10μm)。从染色粒向两侧伸出两个相类似的侧环，每个环相当于一个袢环结构域，一个平均大小的环约含100 kb DNA。两栖类套灯刷染色体约含1000个这样的染色质侧环，不同的侧环有各自的特异DNA序列，每个环在细胞中有4个拷贝。灯刷染色体的形态与卵子发生过程中营养物储备是密切相关的。大部分DNA以染色粒形式存在，没有转录活性，而侧环是RNA活跃转录的区域，一个侧环往往是一个大的转录单位或几个转录单位组合构成的。转录的RNA副本3端借助RNA聚合酶固定在侧环染色质轴丝上，游离的5端捕获大量蛋白质形成核糖核蛋白复合物，组成环周围的基质。环的粗细变化表示基质的厚薄和转录RNA的长短。转录起始点RNA短，随着RNA聚合酶读码而逐渐延长。用 RNase和蛋白酶可将基质消化，侧环轴丝保留。改用 DNase消化，侧环轴丝解体消失，说明基质由RNP组成，轴丝由DNA组成。灯刷染色体合成的RNA主要为前体mRNA，有些类型的mRNA可翻译成蛋白质，有些mRNA与蛋白质结合，暂不翻译而储存在卵母细胞中。
