第2节 微生物的培养技术和应用
一 微生物的基本培养技术
防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。在实验室培养微生物，一方面要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件；另一方面要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。
培养基的配制
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质——培养基（culture medium），用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。其中，不含凝固剂（如琼脂）、呈液体状态的培养基为液体培养基，呈固体状态的培养基为固体培养基。在液体培养基中加入琼脂后制成的琼脂固体培养基，是实验室中最常用的培养基之一。微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落(colony)（图1-6）。
虽然各种培养基的配方不同，但一般都含有水、碳源（提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质）和无机盐等营养物质。下面让我们一起来看一看某种常见的细菌培养基的营养构成（表1-1）。
在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。例如，在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；在培养霉菌时，需要将培养基调至酸性；在培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性；在培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。
无菌技术
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括消毒和灭菌。
消毒（disinfection）是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。灭菌（sterilization）则是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。消毒和灭菌工作主要包括两个方面：对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。常用的消毒方法有煮沸消毒、巴氏消毒等；灭菌方法有湿热灭菌、干热灭菌和灼烧灭菌等。
做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。
相关信息
生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。例如，有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。
资料卡 常用的消毒和灭菌方法
消毒 日常生活中经常用到煮沸消毒法。在100℃煮沸5～6min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。对于一些不耐高温的液体，如牛奶，则可使用巴氏消毒法，即在62～65℃消毒30min或80～90℃处理30s～1min，可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且不破坏牛奶的营养成分。此外，人们也常使用化学药物进行消毒，如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。
除了以上方法，还常用紫外线进行消毒。例如，接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。
湿热灭菌 这是一种利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。其中高压蒸汽灭菌的效果最好。实验室常用的高压蒸汽灭菌锅（见左图）就是以水蒸气为介质，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，维持15～30min来灭菌的。
干热灭菌 将灭菌物品放入密闭容器如干热灭菌箱，在160～170℃的热空气中维持2～3h可以达到灭菌的目的。耐高温的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等，可以采用这种方法灭菌。
灼烧灭菌 将微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌（见下图）。此外，在接种过程中，试管口、瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌。
微生物的纯培养
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。下面我们以酵母菌的纯培养为例，通过实际操作来学习微生物纯培养技术。
探究实践 酵母菌的纯培养
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。下而，我们尝试在马铃薯琼脂培养基上进行酵母菌的纯培养。
目的要求
- 学会配制培养酵母菌的培养基并倒平板。
- 学会进行无菌操作。
- 尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落。
材料用具
酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖（或蔗糖）、琼脂、蒸馏水、天平、小刀、纱布、烧杯、锥形瓶、棉塞、牛皮纸（或报纸）、皮筋、培养皿、接种环、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱和恒温培养箱等。
方法步骤
- 制备培养基
配制培养基 称取去皮的马铃薯200g，切成小块，加水1 000mL，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、15～20g琼脂，用蒸馏水定容至1 000mL。
灭菌 将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15～30min。将5～8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160～170℃灭菌2h。
倒平板 待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。倒平板的具体操作步骤如下。
- 接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。平板划线的具体操作见下面的流程图。
- 培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24～48h。
思维训练 评估论点的可信程度
有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水，密封，置于阴凉处发酵一至两周。
有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论点是否可信。追问以下问题可以帮助你分析。
“酵素"是什么？水果“酵素"的制作原理是什么？水果“酵素"中可能含有哪些成分？它是否含有人们无法从其他食品中获取但又是维护健康所必需的成分？水果“酵素"中的所有成分都有益于人体健康吗？
如果要更加有力地支持或反驳水果“酵素"有益健康的论点，应该怎样获取证据？
二 微生物的选择培养和计数
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办呢？
选择培养基
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌（Thermus aquaticus），进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应（PCR）。为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？这是因为水生栖热菌能在70~80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。实验室中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，即人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基（selective medium）。
思考讨论 选择培养基配方的设计
尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。
微生物的选择培养
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，仅有选择培养基是不够的，还需要对土样进行适当的处理以及科学的测定微生物数量的方法。由于土壤中细菌的数量庞大，要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须要对土样进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上，也就是要采用稀释涂布平板法，其操作如图1-7所示。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落（图1-8）。
微生物的数量测定
稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30～300、适于计数的平板。在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
值得注意的是，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。除上述的活菌计数外，利用显微镜进行直接计数，也是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
相关信息
细菌计数板和血细胞计数板的计数原理相同。血细胞计数板比细菌计数板厚，常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。用细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
探究实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
提出问题
土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？
基础知识
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌，该选择培养基的配方见右栏。
实验设计
请你根据前面学过的微生物的选择培养、数量测定的知识以及下面的资料，思考有关问题，然后进行实验设计，并写出详细的实验方案。
【资料一】土壤取样
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表3～8cm的土壤层。因此，取样时一般要铲去表层土。在城市，常见的是公园里、街道旁、花盆中的土壤；在农村，则容易收集到农田或菜园里的土壤。你打算选择什么样的土壤做实验呢？
【资料二】样品的稀释
测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105，和×106倍稀释的稀释液进行平板培养。测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？如果不同，你打算选用多大的稀释范围？
当你第一次做这个实验的时候，可以将稀释的范围放宽一点。例如，可以将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
【资料三】微生物的培养与观察
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。本实验中，我们可以每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征。请仔细观察你所分离到的菌落，最好以表格的形式将不同菌落的特征（如形状、大小和颜色等）记录下来。
操作提示
请你根据自己设计的实验方案进行操作。操作中应特别注意以下问题。
- 将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
- 要按照前面学习过的无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
- 本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
- 本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
结果分析与评价
- 结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
- 你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
- 你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？
进一步探究
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌，对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料，进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
课后补充：刚果红与纤维素形成红色复合物。
