第2节 动物细胞工程
动物细胞工程常用的技术包括动物细胞培养、动物细胞融合和动物细胞核移植等，其中动物细胞培养（animal cell culture）是动物细胞工程的基础。
一 动物细胞培养
人造皮肤的构建、动物分泌蛋白的规模化生产等，都离不开动物细胞培养。动物细胞培养是指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。那么，动物细胞培养需要哪些必要的条件？培养的过程又是怎样的呢？
动物细胞培养的条件
我们知道，动物体内的细胞之所以能够维持正常的生命活动，有些细胞还能不断增殖，是因为机体给这些细胞提供了适宜的条件，包括充足的营养、稳定的内环境等。在体外培养动物细胞，也需要满足类似的条件。
一般来说，动物细胞培养需要满足以下条件（图2-9）。
营养 细胞在体外培养时，培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质。将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分。培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。
无菌、无毒的环境 在体外培养细胞时，必须保证环境是无菌、无毒的，即需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作。培养液还需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
温度、pH和渗透压 维持细胞生存必须有适宜的温度。哺乳动物细胞培养的温度多以36.5±0.5℃为宜。多数动物细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。此外，渗透压也是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要环境参数。
气体环境 动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶（图2-10），并将它们置于含有95％空气和5％CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
动物细胞培养的过程
在从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖。因此，在进行细胞培养时，首先要对新鲜取材的动物组织进行处理，或用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间，将组织分散成单个细胞。然后，用培养液将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。体外培养的动物细胞可以分为两大类：一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖；另一类则需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，大多数细胞属于这种类型（图2-11），这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素的影响外，还会发生接触抑制现象，即当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。这时就需要对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖。人们通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养，将分瓶后的细胞培养称为传代培养。在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养（图2-12）。
进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？
干细胞培养及其应用
干细胞（stem cell）的培养成功是动物细胞培养领域重大的成就之一，干细胞的应用前景吸引着众多科学家投入到相关研究中。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。干细胞存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中，包括胚胎干细胞和成体干细胞等。
胚胎干细胞（embryonic stem cell，简称ES细胞）存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能（图2-13）。自1981年科学家首次分离得到小鼠的ES细胞后，目前科学家已经分离了兔、牛、猴和人等的ES细胞，并证明了ES细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等细胞。成体干细胞是成体组织或器官内的干细胞，包括骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞和睾丸中的精原干细胞等。一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。造血干细胞是发现最早、研究最多、应用也最为成熟的一类成体干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。
有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有着广泛的应用。例如，将正常的造血干细胞移植到病人体内，恢复病人的造血和免疫功能，已成为治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病的一种重要手段；神经干细胞在治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）方面有重要的应用价值。
胚胎干细胞必须从胚胎中获取，这涉及伦理问题，因而限制了它在医学上的应用。2006年，科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将它称为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，简称iPS细胞），并用iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。现在，用iPS细胞治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。因为诱导过程无需破坏胚胎，而且iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应，所以科学家普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞（图2-14)。
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科学家已尝试采用多种方法来制备iPS细胞，包括借助载体将特定基因导入细胞中，直接将特定蛋白导入细胞中或者用小分子化合物等来诱导形成iPS细胞。iPS细胞最初是由成纤维细胞转化而来的，后来发现已分化的T细胞、B细胞等也能被诱导为iPS细胞。
干细胞的研究正在如火如荼地开展。虽然将干细胞用于临床治疗还面临一些问题，如存在导致肿瘤发生的风险，但是我们相信，随着理论和技术的不断完善，干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。
二 动物细胞融合技术与单克隆抗体
我们知道，运用植物体细胞杂交技术，可以跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。那么，有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？
动物细胞合技术
动物细胞融合技术（cell fusion technique）就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。
动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同。诱导动物细胞融合的常用方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。
细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。人们可以按照预先的设计使不同细胞融合，至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得了成功。目前，这一技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的市要手段，特别是利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤（hybridoma）技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
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灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。灭活病毒诱导细胞融合的原理是：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。
从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。
思考讨论 单克隆抗体及其应用
早期人们为了获得抗体，就向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。用这种方法制备的抗体不仅产量低、纯度低，而且特异性差。为了解决这一难题，科学家进行了多年的研究和探索。他们发现，哺乳动物感染病原体后，体内会形成相应的B淋巴细胞，这些细胞能分泌抗体，抗体识别并特异性结合病原体，从而抑制病原体的增殖等。动物体内产生的特异性抗体的种类可多达百万种以上，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群。遗憾的是，在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的，怎样解决这一问题呢？
1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒在前人工作的基础上，充分发挥想象力，设计了一个极富创造性的实验方案。他们想到，如果把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞融合，所得到的融合细胞就可能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。根据该设想，通过实验，他们得到了单克隆抗体（图2-15、图2-16）。由于这一贡献，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
思考讨论 单克隆抗体的应用
资料1 用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒"，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90％以上。
资料2 使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugates, ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。
单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备，因此被广泛用作诊断试剂，在多种疾病的诊断和病原体鉴定中发挥重要的作用。例如，利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。除前面介绍的单克隆抗体可以运载药物外，单克隆抗体自身也能用于治疗疾病。在医药领域，单克隆抗体药物占有非常重要的地位。2015年，全球销售额排名前十位的药物中，单克隆抗体药物就有5种。同年，我国的单克隆抗体药物市场规模已达72亿元。
三 动物体细胞核移植技术和克隆动物
“（悟空）拔一把毫毛，丢在口中嚼碎，望空喷去，叫一声‘变！’即变作三二百个小猴，周围攒簇。”这是《西游记》中的一段描述，展示了中华先贤的想象力。毫毛来自体细胞，我们能用体细胞“变”出猴来吗？
通过前面的章引言，我们知道，这其实已经在某种程度上得到了实现。核移植（nuclear transplantation）相当于孙悟空施的“魔法”，科学家通过它成功培育了克隆猴等克隆动物。动物细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。
哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植（图2-17）。由于动物胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易，而动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难，因此动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。而在动物体细胞核移植中，非人灵长类动物的体细胞核移植非常困难。主要原因一方面是供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，这导致了胚胎发育率低；另一方面是对非人灵长类动物胚胎进行操作的技术尚不完善。我国科学家经过多年努力，攻克了这些障碍，终于成功获得了体细胞克隆猴。
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减数分裂II中期（MII期）卵母细胞中的“核”其实是纺锤体-染色体复合物。文中所说的“去核”是去除该复合物。
体细胞核移植的过程
应用体细胞核移植技术，我国已成功地克隆了牛、羊、猪和猴等多种哺乳动物。下面以克隆高产奶牛为例，来说明体细胞核移植的大致过程（图2-18）。
从屠宰场收集牛卵，采集卵母细胞（左边照片为研究人员正在使用设备从牛的卵巢采集卵母细胞），在体外培养到MII期。
通过显微操作去核。
从供体高产奶牛身体的某一部位（如耳）上取体细胞，进行培养。
将供体细胞注入去核的卵母细胞。
通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞，形成重构胚。
用物理或化学方法（如电刺激、Ca2+载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂等）激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程。
将胚胎移入受体（代孕）母牛体内
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
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重构胚是指人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。
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目前动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是显微操作法。也有人采用梯度离心、紫外线短时间照射和化学物质处理等方法。这些方法是在没有穿透卵母细胞透明带的情况下去核或使其中的DNA变性。
体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题
体细胞核移植技术在畜牧业、医药卫生以及其他领域有着广泛的应用前景。在畜牧生产中，利用体细胞核移植技术，可以加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育。在医药卫生领域，通过建立转基因体细胞系，再利用体细胞核移植技术培育的转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产许多珍贵的医用蛋白；在治疗人类疾病时，转基因克隆动物的细胞、组织或器官可以作为异种移植的供体；以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，将它们移植给患者时可以避免免疫排斥反应。此外，研究克隆动物可使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程；克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因；克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病的致病机制和开发相应的药物提供帮助。在保护濒危物种方面，该技术有望增加濒危物种的存活数量。
尽管通过体细胞核移植技术已经获得了多种克隆动物，但该技术的成功率仍然非常低，各个技术环节也有待进一步改进。相对于技术研究，核移植的理论研究较为滞后，需要与发育生物学、细胞生物学和分子遗传学等学科更深层次的理论研究相结合。此外，一些研究者指出，绝大多数克隆动物存在健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷和免疫失调等。总之，体细胞核移植技术的研究仍在继续深入，人类对克隆技术的应用还有许多问题需要解决。期待在不远的将来，克隆技术能更好地造福于人类。
▲到社会中去
我国科学家已成功地克隆了牛、羊和猪等多种哺乳动物，这些研究成果目前已经转化为生产力了吗？请你查阅资料、专利文献等，了解以下信息：哪些成果已经在生产实践上得以应用，其经济价值如何？哪些成果还没有在生产实践中得到推广，其限制因素是什么？
