第一节 细胞内蛋白质的分选
在真核细胞中，除少量蛋白质在线粒体和叶绿体内合成外，绝大多数蛋白质都是由核基因编码，或在游离的核糖体上合成，或在糙面内质网膜结合的核糖体上合成。然而，蛋白质合成以后必须转运到达特定的部位才能参与组装细胞结构，发挥其生物学功能，这一过程称为蛋白质靶向转运( protein targeting)或蛋白质分选( protein sorting)。蛋白质分选是涉及多种信号调控的复杂而重要的细胞生物学热点问题。
一、信号假说与蛋白质分选信号
Palade发现，在细胞质的游离核糖体上合成的是非分泌蛋白，而在内质网附着核糖体上能合成分泌蛋白。但细胞学家们并没有发现能够解释游离核糖体和附着核糖体功能差异的原因。 Palade的学生G. Blobel假设该差异应存在于蛋白质本身。他和同事D. Sabatini推测分泌蛋白可能在N端携带有短的信号序列。一旦该序列从核糖体翻译合成，结合因子便与该序列结合，指导其转移到内质网膜，后续翻译过程将在内质网膜上进行。这就是1975年 Blobel和 Sabatini提出的信号假说( signal hypothesis)。后来，P. Leder及其同事构建的无细胞翻译系统合成了比正常分泌抗体长6~8个氨基酸的轻链，其他研究者也获得了相似的结果。在对Blobel和 Sabatini的假说不知情的情况下，剑桥大学的Milstein基于他的体外无细胞系统提出了相似假设，但当研究人员检查微粒体的蛋白质时，发现只存在正常长度的蛋白质，他们假设这多余氨基酸序列在指导蛋白质转运至内质网上有重要作用。尽管一些人质疑多出的段肽链是体外翻译和分离的错误，但 Blobel等人设计了一种蛋白质体外翻译-转运系统，获得了一系列信号假说的证据，如利用鼠的mRNA、兔的核糖体和狗的内质网(胰腺微粒体)组建的翻译-转运系统可能是一个通用系统。探究细胞内蛋白质转运机制的诸多细节花费了20多年时间，其中洛克菲勒大学的 Blobel在1999年因此获诺贝尔生理学或医学奖。
已知指导分泌蛋白在糙面内质网上合成的决定因素包括：蛋白质N端的信号肽(signal sequence e signal peptide)、信号识别颗粒(signal recognition particle， SRP)和内质网膜上信号识别颗粒的受体(又称停泊蛋白， docking protein，DP)等因子共同协助完成的。
信号肽位于蛋白质的N端，一般由16-26个氨基酸残基组成，其中包括疏水核心区、信号肽的C端和N端等三部分(图6-1)；原核细胞某些分泌蛋白的N端也具有信号序列。信号肽似乎没有严格的专一性，如大鼠的胰岛素原蛋白接上真核或原核细胞的信号肽，均可通过大肠杆菌的细胞质膜分泌到细胞外。
信号识别颗粒(SRP)是一种核糖核蛋白复合体(图6-2)，由6种不同的蛋白质和一条长度约为300个核苷酸的7SRNA组成，SRP通常存在于细胞质基质中，等待信号肽从多聚核糖体上延伸暴露出来，SRP既可与新生肽信号序列和核糖体大亚基结合，又可与内质网膜上SRP受体结合。SRP受体是内质网膜上的整合蛋白，由α和β亚基组成，可特异地与SRP结合。当SRP的p54亚基和SRP受体的a亚基与GTP结合时会增进SRP/新生肽/核糖体复合物与SRP受体结合的强度。
应用体外无细胞系统( cell free system)进行蛋白质合成实验，证实分泌蛋白向rER腔内的转运是同蛋白质翻译过程偶联进行的，这种分泌蛋白在信号肽引导下边翻译边跨膜转运的过程称为共翻译转运(cotranslational translocation)体外无细胞系统蛋白质合成的实验证实，在分泌蛋白合成过程中信号肽、信号识别颗粒和停泊蛋白之间的相互关系显示在表6-1中。
根据已有研究资料和证据，对表6-1中的结果及分泌蛋白在内质网上合成的共翻译转运过程可概括为如图6-3所示。
蛋白质首先在细胞质基质游离核糖体上起始合成，当多肽链延伸至约80个氨基酸残基时，N端的内质网信号序列暴露出核糖体并与SRP结合，导致肽链延伸暂时停止，防止新生肽N端损伤和成熟前折叠(图6-3步骤1和2)，直至SRP与内质网膜上的SRP受体结合，将核糖体-新生肽复合物附着到内质网膜上(图6-3步骤3)，当2分子GTP分别与SRPp54亚基和SRP受体α亚基结合时，这种结合复合物的相互作用被强化。核糖体一新生肽复合物与内质网膜的移位子( translocon)结合，SRP脱离了信号序列和核糖体，返回细胞质基质中重复使用，肽链又开始延伸。以环化构象存在的信号肽与移位子组分结合并使孔道打开信号肽穿入内质网膜并引导肽链以袢环的形式进入内质网腔中，这是一个耗能过程(图6-3步骤4)。与此同时，腔面上的信号肽酶切除信号肽并快速使之降解(图6-3步骤5)。肽链继续延伸，直至完成整个多肽链的合成(图6-3步骤6)，蛋白质进入腔内并折叠，核糖体释放，移位子关闭(图6-3步骤7和8)。
引导新生肽链穿过移位子的信号肽可视为起始转移序列(start transfer sequence)。肽链中还可能存在某些内在序列与内质网膜有很强的亲和力从而使之结合在脂双层之中，这段序列不再转入内质网腔中，称之为内在停止转移锚定序列(internal stop-transfer anchor sequence，STA)和内在信号锚定序列( internal signal anchor sequence，SA)。如果一种多肽只有N端信号序列而没有停止转移锚定序列，那么这种多肽合成后一般进入内质网腔中，如果一种多肽的停止转移锚定序列位于多肽的内部，那么这种多肽最终会成为内质网的膜蛋白。含有多个起始转移序列和多个停止转移锚定序列的多肽将成为多次跨膜的膜蛋白。跨膜蛋白的拓扑学结构可能就是由这些蛋白质一级结构中的起始和停止转移序列共同决定的。在rER合成的整合膜蛋白根据拓扑学特征大体上可分为4类(图6-4)，它们的共同点是多肽链的20~25个疏水氨基酸残基形成跨膜α螺旋，不同点在于是否有N端可切割的ER信号序列，定位方向或跨膜次数也会有所不同，其中单次跨膜蛋白多肽链内在停止转移序列和信号锚定序列决定其拓扑学特征。至于新生肽链的跨膜取向主要受到跨膜片段侧翼氨基酸残基的电荷分布的影响，一般而言，带正电荷氨基酸残基侧朝向细胞质基质一侧。
线粒体、叶绿体中绝大多数蛋白质以及过氧化物酶体中的蛋白质也是在某种信号序列的指导下进入这些细胞器中。为了研究方便，有人将这种信号序列称之为导肽( leader peptide)，其基本特征是蛋白质在细胞质基质中合成以后再转移到这些细胞器中，因此称这种翻译一转运方式为翻译后转运( post-translational translocation)。这种转运方式在蛋白质跨膜过程中不仅需要消耗ATP使多肽去折叠，而且还需要一些分子伴侣蛋白的协助(如热激蛋白Hsp70)以帮助这类转运蛋白正确折叠形成有功能的蛋白质。继发现信号肽序列之后，人们又相继发现一系列蛋白质分选信号序列(表6-2)，统称信号序列( signal sequence)。有些信号序列还可形成三维结构的信号斑( signal patch)，指导蛋白质转运至细胞的特定部位。
二、蛋白质分选转运的基本途径与类型
核基因编码的蛋白质的分选大体可分两条途径：
(1)翻译后转运途径即在细胞质基质游离核糖体上完成多肽链的合成，然后转运至膜围绕的细胞器，如线粒体、叶绿体、过氧化物酶体及细胞核，或者成为细胞质基质中的可溶性驻留蛋白和骨架蛋白(图6-5右侧)。人们最近在酵母细胞中也发现有些分泌蛋白不像大多数真核细胞那样，边合成边跨膜转运，而是由结合ATP的分子伴侣BP蛋白(BiP-ATP)与膜整合蛋白Sec63复合物相互作用，水解ATP提供动力驱动翻译后转运途径，即分泌蛋白在细胞质基质游离核糖体上合成，然后再转运至内质网中。
(2)共翻译转运途径即蛋白质合成在游离核糖体上起始之后，由信号肽及其与之结合的SRP(信号肽-SRP)引导转移至糙面内质网，然后新生肽边合成边转入糙面内质网腔或定位在ER膜上，经转运膜泡运至高尔基体加工包装再分选至溶酶体、细胞质膜或分泌到细胞外，内质网与高尔基体本身的蛋白质分选也是通过这一途径完成的(图6-5左侧)。
根据蛋白质分选的转运方式或机制不同，又可将蛋白质转运分为四类：
(1)蛋白质的跨膜转运( transmembrane transport)主要是指共翻译转运途径中，在细胞质基质中起始合成的蛋白质，在信号肽-SRP介导下与内质网膜上SRP受体结合转移到内质网，然后边合成边转运，或进入内质网腔或插入内质网膜；此外是指翻译后转运途径中，在细胞质基质核糖体上完成合成的多肽链在不同靶向信号序列指导下，依不同的机制转运到线粒体、叶绿体和过氧化物酶体等细胞器。
(2)膜泡运输( vesicular transport)蛋白质通过不同类型的转运膜泡从糙面内质网合成部位转运至高尔基体进而分选转运至细胞的不同部位。膜泡运输涉及供体膜出芽形成不同的转运膜泡、依赖细胞骨架和分子马达的膜泡运输以及膜泡与靶膜的融合等过程。
(3)选择性的门控转运( gated transport)在细胞质基质中合成的蛋白质通过核孔复合体在核-质间双向选择性地完成核输入或核输出，参见第九章第一节关于核孔复合体的选择性运输。
(4)细胞质基质中蛋白质的转运上述几种分选类型也涉及蛋白质在细胞质基质中的转运，这一过程显然与细胞骨架系统密切相关，但由于细胞质基质的组织结构尚不清楚，因此对其中的蛋白质转运特别是信号转导途径中蛋白质分子的转运方式了解甚少。
三、蛋白质向线粒体和叶绿体的分选
与共翻译转运途径中依赖N端信号肽序列靶向内质网的过程不同，翻译后转运途径中要进入到线粒体(图6-6)、叶绿体(图6-7)和过氧化物酶体等细胞器的蛋白质的分选是由多个步骤组成的过程，并需要多个不同的靶向序列( targeting sequence)。定位到叶绿体的前体蛋白的N端具有40~50个氨基酸组成的转运肽( transit peptide)，用以指引多肽定位到叶绿体并进一步穿过叶绿体被膜进入基质或类囊体中。转运到线粒体和过氧化物酶体的蛋白质与此类似，但靠的是不同的引导序列，即线粒体蛋白N端的导肽或过氧化物酶体蛋白C端的内在靶向序列(见表6-2)。至于这些细胞器蛋白最终是定位在不同的膜上还是不同的基质空间，除不同转运肽之外，还需要其他参与空间定位的信号序列。此外，通过翻译后转运途径进入线粒体、叶绿体和过氧化物酶体等细胞器的蛋白质，也必须在分子伴侣的帮助下解折叠或维持非折叠状态，以顺利通过膜上的输入装置。蛋白质输入这些细胞器通常是需要能量的过程。
1.蛋白质从细胞质基质到线粒体的转运
大部分线粒体蛋白是由核基因编码的，这些蛋白质在细胞质基质游离核糖体上合成后被转运到线粒体发挥功能。
(1)蛋白质从细胞质基质输入到线粒体基质所有线粒体基质蛋白的N端靶向信号序列虽然不尽相同，但共享相似的基序( motif)，由20~50个氨基酸残基组成，富含疏水氨基酸，带正电荷的碱性氨基酸(Arg Lys)和羟基氨基酸(Ser、Thr)，缺少带负电荷的氨基酸(Asp、Glu)。这样的氨基酸残基组成有利于基质蛋白的靶向信号序列形成两亲的α螺旋构象，并且实验表明，两亲的N端靶向信号序列对于指导蛋白质输入线粒体基质是至关重要的。蛋白质从细胞质基质输入到线粒体基质的基本步骤如图6-6A所示：在游离核糖体上合成的前体蛋白，与分子伴侣Hsp70结合，并使其保持未折叠或部分折叠状态。其N端具有线粒体基质靶向序列(步骤1)，前体蛋白与内外膜接触点附近的输入受体(Tom20/22)结合(步骤2)，被引进输入孔(步骤3)，输入的蛋白质进而通过内外膜接触点的输入通道(外膜为Tom40，内膜为Tim23/17，步骤4、5)，线粒体基质分子伴侣Hsp70与输入的蛋白质结合并水解ATP以驱动基质蛋白的输入。输入蛋自的基质靶向序列在基质蛋白酶作用下被切除，同时Hsp70也从新输入的基质蛋白上释放下来(步骤6)，折叠成活性形式(步骤7)。
(2)线粒体内膜蛋白的输入如图6-6B所示，途径a和途径b输入的线粒体蛋白其N端都有基质靶向序列，在线粒体外膜上都利用Tom40为输入孔道，外膜上Tom22/20作为识别N端基质靶向序列的输入受体，内膜转运蛋白都是Tm23/17，但通过途径b输入的内膜蛋白(如ATP合酶亚基9)不但具有N端基质靶向序列，还具有内在的疏水结构域，前者引导前体蛋白进入线粒体基质，后者可被内膜蛋白Oxa1所识别，Oxal是一种与内膜蛋白插入相关的蛋白质，由线粒体基因组编码，在线粒体基质核糖体上合成。因此，这类线粒体内膜蛋白通过途径b，其前体先进入基质，基质靶向序列被切割后再装配到内膜上。在a和b两种途径中，基质Hsp70与输入基质可溶性蛋白起相同作用。在途径c中，输入的内膜蛋白是多次跨膜蛋白(如6次跨膜的 ADP/ATP反向交换蛋白)，缺少N端基质靶向序列，含有被Tom70/Tom22输入受体识别的多个内在靶向序列，内膜的转运通道Tim22/54也与a、b途径有所不同。此外，在途径c中两种膜间空间蛋白(Tim9/Tim10)被认为起分子伴侣的作用，协助输入蛋白在外膜与内膜通道之间的转运。
(3)线粒体膜间隙蛋白的输入如图6-6C所示，蛋白质从细胞质基质输入到线粒体膜间隙的途径有两种：途径a是从细胞质基质输入到线粒体膜间隙的主要途径，其过程与内膜蛋白途径a类似(图6-6B)主要不同是蛋白质(如细胞色素b2)内在靶向序列定位在膜间隙，并且在转运过程中被内膜上蛋白酶于膜间隙一侧切割，然后释放的蛋白质折叠并与血红素结合；途径b转运的蛋白质通过外膜Tom40输入孔，直接进入膜间隙。
2.蛋白质从细胞质基质向叶绿体的分选：基质与类囊体蛋白的靶向输入
叶绿体的结构比线粒体还要复杂，除外膜、内膜叶绿体基质以外，还有相对独立的类囊体，由核基因编码的叶绿体基质蛋白包括所有卡尔文循环有关的酶和1，5-二磷酸核酮糖羧基歧化酶( Rubisco)的小亚基都是在细胞质基质合成后输入到叶绿体基质的。这些前体蛋白均具有N端基质输入序列( stromal- Import sequence)，与线粒体基质蛋白的输入过程基本相似，前体蛋白以非折叠形式输入，并有赖于基质Hsp70的作用和ATP提供能量；与线粒体不同的是，叶绿体不产生跨内膜的电化学梯度，因此ATP水解供能几乎是唯一动力来源。
定位在类囊体膜和类囊体腔的许多蛋白质与光合作用相关，其中大多数是在细胞质基质中以前体形式合成的，多肽链上含有多个靶向序列。以质体蓝素蛋白前A(plastocyanin precursor)和金属结合蛋白前体( metal binding precursor)为例，如图6-7所示，尚未折叠的两种蛋白前体首先通过外膜上相同的转运基质蛋白的通道进入基质，N端基质靶向序列被基质蛋白酶切除，从而使类囊体靶向序列暴露(图6-7步骤1)；进入基质后这两种蛋白的转运途径产生分歧，一个是SRP依赖途径：质体蓝素及类似的蛋白质在基质空间保持非折叠状态，这需要一组分子伴侣参与(图中未示)，在类囊体靶向序列指导下与叶绿体SRP(和细菌SRP密切相关)结合，然后在类囊体膜上叶绿体SRP受体在转运蛋白secY的介导下，转运到类囊体腔(图6-7步骤2)；进入腔内后，质体蓝素的类囊体靶向序列被内切蛋白酶( endoprotease)切除，蛋白质折叠产生成熟构象(图6-7步骤3)。另一种是pH依赖的途径：非折叠的金属结合蛋白的N端基质靶向序列首先被切除，然后金属结合蛋白在基质中折叠并与其辅因子结合(图6-7步骤2)，在类囊体靶向序列N端的两个精氨酸残基和跨叶绿体内膜的p梯度是折叠蛋白输入到类囊体腔所必需的(图6-7步骤3)；类囊体膜上的转运蛋白至少由4种与细菌质膜相关的蛋白质组成，输入到类囊体腔的金属结合蛋白其N端的类囊体靶向序列被切除，产生成熟的构象(图6-7步骤4)。
