第二节 细胞内膜泡运输

一、膜泡运输概述

在高度区室化的真核细胞中，细胞生命活动有赖于细胞内部各结构组分之间的协同作用。由内膜系统构成的各区室之间物质的输送通常是靠膜泡的方式进行，如内质网、高尔基体和溶酶体等细胞器之间蛋白质的转运，细胞分泌物的释放和内吞物向溶酶体的转运也是通过膜泡进行的。膜泡运输，是指从细胞内膜系统的某个细胞器(包括内体)表面出芽形成的囊泡，或者是由细胞膜内陷形成的内吞泡在分子马达的介导下沿微管或微丝(相关内容见第八章)转运到目的地，并与靶细胞器或细胞膜融合的过程。通过这一过程将一个细胞器中的物质转运到另一个细胞器中，或分泌到细胞外。膜泡运输是真核细胞内一种最重要的运输系统。例如，对控制血糖具有重要作用的胰岛素，正是借助膜泡进行精确传递并最终释放在血液中。2013年两位美国科学家J.E. Rothman和R.W. Schekman和一位德国科学家T.C. Sudhof因为解答了细胞如何组织其内部的运输系统—囊泡运输系统的奥秘而获得诺贝尔生理学或医学奖。这三位科学家中，美国加州大学伯克利分校的Schekman以酵母温度敏感突变株为材料发现了能控制细胞运输系统不同方面的三类基因，从基因层面上为了解细胞中囊泡运输的严格管理机制提供了新线索；耶鲁大学的 Rothman在20世纪90年代发现了 SNARE蛋白复合体介导膜的融合；基于前两位美国科学家的研究，德国科学家 Sudhof在研究突触信息传递中，发现并解释了膜泡如何在神经指令下由Ca2触发并精确地释放出内部的神经递质。若膜泡运输系统发生病变，细胞运输机制随即不能正常运转，可能导致神经系统病变、糖尿病以及免疫紊乱等严重后果，正如诺贝尔奖评选委员会在声明中所说，“没有膜泡运输的精确组织，细胞将陷入混乱状态”。因此，细胞必须依赖有效而精密的机制，确保在糙面内质网合成的各种蛋白质，加工后在高尔基体TGN区通过形成不同的转运膜泡以不同的途径被分选、运输，各就各位，在特定时间和位点发挥其特定功能。膜泡运输是蛋白质分选的一种特有的方式，普遍存在于真核细胞中。在转运过程中不仅涉及蛋白质本身的修饰、加工和组装，还涉及多种不同膜泡靶向运输及其复杂的调控过程。在细胞分泌与胞吞过程中，以膜泡运输方式介导蛋白质分选途径形成细胞内复杂的膜流( membrane flow)(图6-8)，这种膜流具有高度组织性方向性并维持其动态平衡。

在细胞内膜系统中，糙面内质网相当于蛋白质合成工厂，而高尔基体是重要的枢纽和集散中心。由于内质网的驻留蛋白具有回收信号，即使有的蛋白质发生逃逸，也会被回收回来，所以有人将内质网比喻成“开放的监狱”( open prison)。既然高尔基体在细胞的膜泡运输及其随之而形成的膜流中起枢纽作用，那么高尔基体在细胞中的位置如何确定，高尔基体本身的特定成分又是如何保持的呢?对高尔基体特征性蛋白质进行免疫标记，可观察到高尔基体聚集在微管组织中心(MTOC)附近。在有丝分裂过程中用秋水仙素( colchicine)解聚微管后，高尔基体也裂解成若干小囊泡分散在细胞质中。当微管再装配时，囊泡又沿微管移向MTOC，重新形成高尔基体，这种运动方式与内质网相反，推测在高尔基体膜囊上结合有类似动力蛋白的马达蛋白，从而使高尔基体靠近中心体，并维持其极性。高尔基体不同的膜囊具有各自不同的成分。同样，内质网、溶酶体、分泌泡和细胞质膜及内体也都具有各自相对稳定的特异性成分，这是行使复杂膜泡运输功能的物质基础。例如，SRP受体仅存在于内质网膜上，而特定的糖苷转移酶和寡糖加工酶仅存在于一定的高尔基体膜囊上。然而由内质网合成的蛋白质，其中包括膜蛋白在通过高尔基体的转运与分选过程中经历了多次囊泡形成和与特定靶膜的融合过程，因而推测每一步都可能是通过特异信号介导并与相应受体相互作用实现的。蛋白质分子上某些信号可使其长期驻留在内质网或高尔基体中。另一些信号可使蛋白质不断从一个间隔转移到另一个间隔。因此，很多蛋白质分子的表面可能含有多种介导转移与分选的信号。转运膜泡形成或出芽主要发生在膜的特异部位，即蛋白质信号与受体结合的部位。某些有囊膜病毒的出芽释放可看成膜泡转移的一种特例，成分分析表明，在病毒的囊膜中几乎不含有宿主细胞的膜蛋白而仅含病毒的囊膜蛋白。如果把病毒囊膜蛋白看成膜上受体，似乎正是病毒核衣壳上的信号与受体的相互作用，排除了细胞质膜上的其他多种膜蛋白。在细胞内的出芽、胞吞和膜融合过程中，除受体外究竟有多少膜蛋白会从一个细胞间隔进入另一个细胞间隔，目前还不清楚。但实验表明，受体蛋白可以返回原来的膜结构中，如从高尔基体的顺面膜囊返回内质网，从溶酶体返回至高尔基体的TGN以及从受体介导的胞吞泡返回到细胞质膜上。显然这有利于维持特定膜成分的相对稳定。

细胞内膜泡运输需要多种转运膜泡参与，根据转运膜泡表面包被蛋白的不同，目前发现有三种不同类型：COPⅡ(coat protein II)包被膜泡、COPI(coat protein Ⅰ)包被膜泡和网格蛋白/接头蛋白(clathrin adaptor protein)包被膜泡，它们分别介导不同的膜泡转运途径(表6-3，图6-9)。 

二、COP Ⅱ包被膜泡的装配及运输

COPⅡ介导细胞内顺向运输(anterograde transport)过程中从内质网出芽的小泡的形成。COPⅡ由小分子GTP结合蛋白Sar1、Sec23/Sec24复合物、Secl3/sec31复合物以及大的纤维蛋白Secl6等结构组成。COPⅡ包被膜泡是通过胞质可溶性COPⅡ在供体膜(ER膜)出芽时聚合形成的，包被装配的聚合过程受小分子GTP结合蛋白Sar1调控，Sar1隶属GTP酶超家族成员，通过Sar1- GDP/Sarl1-GTP的转换，起分子开关调控作用。该包被膜泡的装配过程如图6-10所示：细胞质中可溶性Sarl-GDP与ER膜蛋白Sec12(鸟苷酸交换因子)相互作用，催化GTP置换GDP形成Sar1-GTP，GTP的结合引发Sarl构象改变暴露出疏水N端并插入ER膜膜结合的Sar1对包被蛋白的进一步装配起募集者作用(步骤1)，Sar1与膜的结合提供了随后Sec23/Sec04复合物的结合位点，从而在ER膜出芽区形成三重复合物Sarl- GTP/Sec23/Sec24(步骤2)，随后，Secl3sec31复合物与三重复合物结合(图中未显示)。因为纯化的Secl3和Sec31蛋白具有自组装形成网格结构的特点，因而发挥COPⅡ包被骨架的作用。最后，大的纤维蛋白Secl6结合在ER膜的胞质表面，一方面与已装配的复合物相互作用，另一方面组织其他包被蛋白的结合，从而增加包被蛋白的聚合效率。当包被组装完成以后，Sec23亚基促进GTP被Sarl水解(步骤3)，Sarl-GDP从膜泡上释放，引发包被去装配而解聚(步骤4)。

膜泡运输既能转运膜蛋白，又能通过膜受体识别并转运可溶性蛋白，其包装特异性取决于被转运蛋白的靶向分选序列(表6-4)，借以区分哪些膜蛋白或可溶性蛋白将被进一步包装转运，哪些将作为滞留蛋白而被排除在外，从而膜泡包被直接选择靶向序列或分选信号。例如内质网被转运的膜蛋白具有二酸(如：Asp-X-Glu)分选信号，Sec24亚基是识别并结合该信号的受体，最终通过COPⅡ包被膜泡从内质网转运到高尔基体(图6-11)。

三、COP I包被膜泡的装配与运输

COPI介导细胞内膜泡逆向运输(retrograde transport)过程中从高尔基体反面膜囊到高尔基体顺面膜囊以及从高尔基体顺面网状区到内质网的货物转运膜泡的形成，包括再循环的膜脂双层、内质网驻留的可溶性蛋白和膜蛋白，是内质网回收错误分选的逃逸蛋白( escaped protein)的重要途径。

COPI包被膜泡首先被分离鉴定，用不能被水解的GTP类似物( GTP analogue)处理细胞，将引起COPI包被膜泡在细胞内聚集，并通过密度梯度离心法可将其从细胞匀浆中分离出来，分析发现COPI包被含有7种不同的蛋白质亚基和一种调节膜泡转运的GTP结合蛋白ARF。和Sarl一样，ARF也是一种结合GDP(GTP的分子开关调控蛋白，包被蛋白复合物( coatomer)的装配与去装配依赖于ARF所结合的核苷酸交换与水解过程；此外，ARF也参与网格蛋白包被膜泡的装配调节。 

是什么因素决定一种特异蛋白是被保留在内质网还是进入高尔基体?已有研究证据显示，细胞器中的蛋白质是通过两种机制保留及回收来维持的：一是转运膜泡将驻留蛋白有效排斥在外，例如，有些驻留蛋白参与形成大的复合物，因而不能被包装在出芽形成的转运膜泡中，结果被保留下来；二是对逃逸蛋白的回收机制，使之返回它们正常驻留的部位。回收逃逸的内质网蛋白是通过回收信号介导的特异性受体完成的。现已发现，内质网的正常驻留蛋白，不管在腔内还是在膜上，它们在C端含有一段回收信号序列( retrieval signal)，如果它们意外地被包装进入转运膜泡从内质网逃逸到高尔基体CGN，则CGN区的膜结合受体蛋白将识别并结合这些逃逸蛋白的回收信号，形成COPI包被膜泡将它们回收到内质网(图6-11B)。如表6-4所示，内质网腔中的可溶性蛋白，如蛋白二硫键异构酶和协助折叠的分子伴侣，均具有典型的KDEL回收信号。如果一个内质网蛋白缺乏KDEL序列，那么这种蛋白质将不能返回内质网，而是被转运膜泡带到质膜。相反，如果通过基因重组方法使表达的溶酶体蛋白或分泌蛋白在C端含有段附加的KDEL序列，那么这种蛋白质将返回内质网，而不是被转运至溶酶体或分泌泡。内质网的膜蛋白如SRP受体，在C端有一个不同的回收信号，通常是KKXX(K：赖氨酸，X：任意氨基酸)，识别并结合该信号的受体是COPI的a和β亚基，从而促进它们返回到ER。

在ER膜上整合蛋白 V-SNARE(供体膜受体蛋白，见下文膜融合)和其他被转运蛋白是通过与包被蛋白的相互作用被包装到转运膜泡的，可溶性转运蛋白通过与出芽膜泡上相应受体的结合而被募集，包被膜泡脱去包被复合物，包被蛋白可再循环利用，而 V-SNARE暴露在小泡膜表面。膜泡脱被后，在小分子GTP结合蛋白Sarl蛋白参与下，脱包被的膜泡留在高尔基体顺面膜囊，暴露的内质网膜蛋白ⅴ SNARE与高尔基体顺面膜囊上同类蛋白 t-SNARE(靶膜受体蛋白，见下文膜融合)相互配对，介导膜泡与靶膜融合，内含物释放进入高尔基体顺面膜囊。内质网腔中的蛋白质(特别是高浓度存在的腔内蛋白质)在出芽过程中可以被动掺入到COPⅡ包被膜泡并转运到高尔基体。许多这类蛋白质带有C端KDEL序列，KDEL的受体主要定位在高尔基体TGN区、COPⅡ和COPI包被膜泡的膜上，它们能识别并结合KDEL分选信号，二者的亲和性对pH变化非常敏感，内质网和高尔基体之间微小的pH差异都有利于携带KDEL序列的蛋白质与高尔基体衍生膜泡上的受体结合，并有助于这些蛋白质从内质网释放。如果在内质网发生错误包装和转运，由于COPI包被膜泡上也有KDEL受体，所以也能保证逃逸蛋白被内质网回收。 

这种通过回收信号所介导的回收机制有利于防止内质网腔蛋白(如用于新合成分泌蛋白正确折叠所需要的分子伴侣)的损失。在生物合成途径中，每种膜组分也许都具有它自身独特的回收信号，所以任凭转运膜泡在特定空间不断运动，但每种细胞器仍可保持它独特的蛋白质组分。 

四、网格蛋白/接头蛋白包被膜泡的装配与运输 

网格蛋白/接头蛋白包被膜泡介导分泌泡和内吞泡的形成，如从高尔基体TGN向细胞膜及内体或向溶酶体、黑(色)素体、血小板囊泡和植物细胞液泡的货物转运过程中膜泡的形成(表6-3)。另外，在受体介导的内吞途径中，网格蛋白还参与内吞泡的形成。高尔基体的TGN区是网格蛋白/接头蛋白包被膜泡形成的发源地，在功能上既是细胞分泌途径中物质转运的主要分选位点，又是网格蛋白包被膜泡的组装位点。典型的网格蛋白/接头蛋白包被膜泡是一类双层包被的膜泡，外层由网格蛋白组成，内层由接头蛋白复合物组成。纯化的网格蛋白分子呈三腿结构( triskelion)，每个分支含一条重链和一条轻链。与COPⅡ的Sec13/Sec31复合物一样，网格蛋白也有自组装形成多角型网格的特性(图6-12)，当网格蛋白在供体膜上聚合，便募集接头蛋白复合物到供体膜的胞质面并与其结合，接头蛋白复合物一方面将网格蛋白网格包被连接到质膜上，另一方面又能特异性地促使一些膜结合蛋白富集到形成包被的膜区。现已发现有三种接头蛋白复合物(AP1、AP2和AP3)，每种接头蛋白复合物含有4种接头蛋白亚基的一个拷贝，形成异四聚体。接头蛋白复合物的一个亚基与网格蛋白重链远端的球形结构域特异性结合，一方面促进三腿网格蛋白与接头蛋白复合物的联合装配，同时也增加已装配包被的稳定性。正如小分子GTP结合蛋白ARF参与启动COPI包被装配一样，ARF也参与网格蛋白/接头蛋白包被的起始装配。除三种接头蛋白复合物之外，还发现另一类接头蛋白GGA，由单一多肽链组成。接头蛋白复合物或GGA在膜泡的胞质面与转运的膜蛋白或膜受体(结合腔内可溶性蛋白)特异性结合，决定哪些蛋白将被包装转运或哪些蛋白将被排除在外。这种特异性是由转运蛋白的分选信号决定的(表6-4)。网格蛋白/接头蛋白包被膜泡形成的首要步骤是供体膜岀芽和包被的装配，芽体如何缢缩并与供体膜断裂是网格蛋白/接头蛋白包被膜泡形成的关键，发动蛋白( dynamin)具有GTP酶活性，它所介导的网格蛋白包被膜泡的组装模式见图6-12C。在供体膜上网格蛋白/接头蛋白包被小泡出芽形成后，发动蛋白围绕颈部聚合，然后催化GTP水解，所释放的能量驱动发动蛋白构象改变，导致网格蛋白/接头蛋白包被膜泡从供体膜断裂并释放。如果人为使细胞表达突变型的发动蛋白，其将不能结合GTP并使之水解，也不形成独立的网格蛋白/接头蛋白包被膜泡，而是产生发动蛋白聚合包绕具有较长颈部的膜泡芽体。现在尚未发现GTP酶也参与COPⅠ和COPⅡ包被膜泡芽体从供体膜的断裂，更不清楚不同类型的包被膜泡断裂会有如此差异。但与COPⅠ和COPⅡ包被膜泡一样，通常情况下网格蛋白/接头蛋白包被膜泡形成后不久便脱去包被，网格蛋白/接头蛋白包被的解聚一方面涉及ARF开关蛋白从结合GTP状态转变为结合GDP状态，另一方面也可能涉及ATP水解提供的能量，鉴于胞质内Hsp70蛋白是所有真核细胞中普遍存在的组成型分子伴侣，因而认为Hsp70致使ATP水解释放的能量用于驱动网格蛋白/接头蛋白包被的去组装过程。脱包被的结果不仅释放三腿网格蛋白被循环再利用，而且由于包被去组装也会使V-SNARE得以暴露，利于膜泡与靶膜的融合。

五、转运膜泡与靶膜的锚定和融合

膜泡转运是十分复杂的过程，在酵母基因组中至少发现25种以上与膜泡转运有关的基因。膜泡运输的关键步骤至少涉及如下过程：①供体膜的出芽、装配和断裂，形成不同的包被转运膜泡，该过程已在前面述及(图6-11C和图6-12B)；②在细胞内由马达蛋白驱动、以微管为轨道的膜泡运输(参见第八章第二节)；③转运膜泡与特定靶膜的锚定和融合。现已知，在膜泡靶向转运过程中，有另一类小分子GTP结合蛋白，即Rab蛋白的参与。和Sar1与ARF蛋白一样，Rab蛋白也属于开关调控蛋白GTP酶超家族成员，在特异性鸟苷酸交换因子(GEF)催化下，胞质中Rab-GDP转换为Rab-GTP，引发Rab构象改变致使其与特定转运膜泡的表面蛋白相互作用，并通过类异戊二烯( isoprenoid)基团插入转运膜泡内。一旦Rab-GTP被结合在膜泡表面，便与靶膜上称作Rab效应器( Rab effector)的结合蛋白相互作用，从而使转运膜泡被锚定在适当的靶膜上(图6-13步骤1)。在膜泡融合发生以后，与Rab蛋白结合的GTP被水解成GDP，随即引发Rab-GDP释放，然后再被用于进行 GDP-GTP交换、结合及水解的下一个周期。有些证据表明，在膜泡融合事件中涉及特异性Rab蛋白的参与，如酵母中Sec4基因编码一种Rab蛋白，如果酵母细胞表达突变的Sec4蛋白，则细胞内将导致分泌泡的积累，而不能与质膜融合。在哺乳类细胞中，Rab5蛋白被定位在作为早期内体的脱被内吞泡上，在无细胞系统实验体系中，早期内体彼此融合需要Rab5的存在。此外，在无细胞提取物中加入GTP，则会促进内体彼此融合的速率。在早期内体膜上发现还存在一种长的卷曲蛋白，称之早期内体抗原1( early endosome antigen1，EEA1)，其功能是作为Rab5效应器而存在，这样，一种内吞泡膜上的Rab5-GTP与另种内吞泡膜上的EEA1特异性结合为膜泡间彼此融合提供了保障机制。

转运膜泡的形成、运输及其与靶膜的融合是一个耗能的特异性过程，涉及多种蛋自质间识别、组装、去组裝的复杂调控，膜泡与靶膜的选择性融合是保证细胞内定向膜流的重要因素之一。如果说小分子GTP结合蛋白Rab主要是控制转运膜泡与相应靶膜的锚定，那么，介导转运膜泡与靶膜融合的主要机制是ⅴ- SNARE/t- SNARE蛋白的配对。有些与融合相关的蛋白质已被分离，特别是从神经细胞中分离出参与特异性的膜泡锚定和融合的蛋白质组分，如神经元突触前膜含有一种突触融合蛋白( syntaxin)，能与突触小泡膜上的膜蛋白VAMP( vesicle-associated membrane protein)特异性地结合，这两种蛋白质的相互作用介导膜的融合和神经递质的释放。尽管酵母与哺乳类在演化上已有10亿年的分歧，而且酵母细胞也没有任何突触传递的功能活性，但却具有编码与突触融合蛋白和WAMP相似蛋白质的基因家族，现已知酵母细胞表达20种以上不同的相关 V-SNARE和 t-SNARE蛋白，在对每一种编码SNARE基因进行突变缺陷分析后，证实了每种 SNARE蛋白所参与的特异性膜融合事件。考察所有融合事件表明， SNARE形成四螺旋束复合体，与1个 VAMP/1个 syntaxin/2个SNAP25组成的复合体一样(图6-13)，其功能都是介导分泌泡与质膜融合，在其他类型的膜泡融合事件中，如COPⅡ包被膜泡与高尔基体顺面网状结构的融合， SNARE复合体四螺旋束的组成(1个V- SNARE/3个 t-SNARE)有所不同。应用体外脂质体融合实验，研究者可以检验各种ⅴ- SNARE和 t-SNARE蛋白组合对供体膜与靶膜之间融合的介导能力，发现只有少数组合可以有效介导膜的融合，说明膜的融合是有选择性的。动物细胞膜泡融合需要一种可溶性的胞质融合蛋白N-乙基马来酰亚胺敏感因子( N-ethylmaleimide sensitive facto，NSF)和几种可溶性NSF结合蛋白(soluble NSF attachment protein， SNAP)， NSF FH SNAP负责介导不同类型膜泡的融合，没有明显特异性。提供特异性保障的是SNAP受体( SNAP receptor，又称SNARE)，每种转运膜泡都有特异的ⅴ SNARE( vesicle SNAP receptor)，能识别并与靶膜上 t-SNARE( target SNAP receptor)彼此配对，形成稳定的卷曲 SNARE复合体，因此正是通过 V-SNARE与 t-SNARE两类蛋白间的互补和相互作用，决定了供体膜泡与靶膜的融合(图6-13)。 SNARE复合体的稳定性是靠蛋白质分子间大量非共价键来维系的，因此融合完成后， SNARE复合体必须消耗AP水解能量而解离，释放的单一 SNARE蛋白亚基再用于另外的融合事件。 

在供体膜上的GEF识别并结合特异性Rab蛋白，诱发GTP置换GDP，鸟苷酸交换引发Rab蛋白构象改变并暴露其共价结合的脂质基团，从而帮助Rab-GTP蛋白锚定在供体膜上，并随膜泡转移，在靶膜上Rab-GTP与Rab效应器结合，这种结合有助于膜泡锚定和v- SNARE与 t-SNARE的配对(步骤1)；V- SNARE蛋白(图中VAMP)与同类 t-SNARE(图中 syntaxin和SNAP25)胞质结构域相互作用，形成稳定的卷曲SNARE复合体，将膜泡与靶膜紧密束缚在一起(步骤2)；伴随 SNARE复合体形成后，供体膜泡与靶膜随即融合(步骤3)；两膜融合后，NSF联合 a-SNAP蛋白随即与 SNARE复合体结合，然后NSF催化ATP水解，驱动 SNARE复合体解离，游离的 SNARE蛋白再用于其他膜泡的融合(步骤4)。具有GTP酶活性的Rab蛋白水解与之结合的GTP，释放可溶性的Rab-GDP进入细胞质。在细胞质中Rab-GDP与GDP解离抑制物(GDI)结合，从而防止Rab蛋白从Rab-GDP复合物中释放出来，直至与GEF发生相互作用。