第一节 线粒体与氧化磷酸化

1890年,德国生物学家 Altmann首先在光学显微镜下观察到动物细胞内存在一种颗粒状结构,取名为生命小体( bioblast)。1897年,C. Benda将之命名为线粒体( mitochondrion,源于希腊语mito:线, chondron:颗粒)。在植物细胞中,F. Meves于1904年首次发现了线粒体,从而确认了线粒体是普遍存在于真核细胞内的重要细胞器。 

一、线粒体的基本形态及动态特征

在动植物细胞中,线粒体是一种高度动态的细胞器,其动态特征包括运动导致的位置和分布的变化以及融合和分裂介导的形态、体积与数目的变化等。

(一)线粒体的形态、分布及数目

借助光学显微镜,早期的科学家观察到的线粒体正如命名时的取意,呈颗粒或短线状,直径0.3~1.0m,长度为1.5~3.0μm。但在许多动、植物的特定细胞或细胞周期的时相中,线粒体的大小和形态可能随着细胞的生命活动呈现出很大的变化。比如,人成纤维细胞中的线粒体可长达40m,植物分生组织细胞中会出现环核的片层状线粒体等。 

线粒体在细胞内的分布与细胞内的能量需求密切相关。能量需求集中的区域线粒体分布密集,反之较为疏散。已有的证据表明,动植物细胞中的线粒体时刻处于依赖细胞骨架和马达蛋白的运动之中。无论线粒体在细胞中表现为随机还是极性分布,均是各线粒体在运动方向和运动速率上受到调控的一个综合结果,但该调控的深层机制尚待解析。

细胞中线粒体的数目同样呈现动态变化并接受调控。首先,不同类型真核生物细胞中线粒体的数目相差较大,而同一类真核细胞中线粒体的数目则相对比较稳定。比如,衣藻和红藻等低等的真核生物每个细胞只含有一个线粒体,而高等动物细胞内含有数百到数千个线粒体,说明细胞中线粒体的数目受到物种遗传信息的调控。在同一种高等动植物体内,细胞内线粒体数目与细胞类型相关,说明细胞内线粒体的数目随着细胞分化而变化。

(二)线粒体的融合与分裂

动植物细胞中均可观察到频繁的线粒体融合与分裂现象。这种现象被认为是线粒体形态调控的基本方式,也是线粒体数目调控的基础。多个颗粒状的线粒体融合可形成较大体积的线条状或片层状线粒体,同时后者也可通过分裂形成较小体积的颗粒状线粒体。当融合与分裂的比值大致处于平衡状态时,细胞内线粒体的数目和体积基本保持不变。反之,则会出现线粒体数目的增加或减少。 

线粒体数目和体积调控的生物学意义尚不完全清楚。通常认为体积较小的颗粒状线粒体易于依赖细胞骨架的动态运输,而体积较大的线粒体则适合在细胞特定的区域呈现相对静态的分布。这样,线粒体的融合与分裂可能是细胞应对生命活动的需求对线粒体进行合理排兵布阵”的手段之一。

频繁的线粒体融合与分裂实际上把细胞中所有的线粒体联系成一个不连续的动态整体。在植物细胞中,可以观察到线粒体融合与分裂的偶联现象,即颗粒状或短线状的线粒体融合后随即发生分裂(图7-1)。该过程频繁发生于细胞内的线粒体之间,通常在数十秒内完成。由于其频发性、不同步性和偶联性,这种类型的线粒体融合与分裂并不改变细胞内线粒体的大小及数目,其生物学意义可能在于线粒体之间共享遗传信息。

1.线粒体融合与分裂的分子基础

线粒体的融合与分裂均依赖于特定基因和蛋白质的参与和调控。

参与和调控线粒体融合的基因最早发现于果蝇,取名为Fzo( fuzzy onion,模糊的葱头)。在野生型果蝇精细胞发育过程中,细胞内的线粒体发生聚集并融合形成一个大体积的球形线粒体。该线粒体膜系统呈同心圆排布,在切片上酷似葱头平切面的结构特征,故被称作“葱头。“模糊的葱头”是一个果蝇突变体(zo),其精细胞中的线粒体同样会聚集到一个球形的区域内,但不发生融合(图7-2)。这样,没有融合的线粒体群在显微镜下不呈同心圆的膜系统特征,“模糊的葱头”因而得名。分子遗传学研究结果表明,决定果蝇精细胞线粒体融合的基因(Fzo)编码一个跨膜的大分子GTP酶,定位在线粒体外膜上(图7-2),介导线粒体融合。

进一步的研究发现,与FzO具有同源性的基因家族广泛存在于酵母和哺乳动物的基因组内。这些基因编码结构类似的大分子GTP酶,其核心功能也是介导线粒体融合。可见,线粒体融合的分子机制在动物进化中高度保守。在哺乳动物中,上述大分子GTP酶被称作线粒体融合素( mitofusin),而编码线粒体融合素的F2o同源基因被称作M(如小鼠的Mm1和Mh2)。由于线粒体融合与分裂的动态平衡维持线粒体的形态和体积,突变的Fz0或Mmh导致线粒体分裂单向发生,细胞内出现线粒体数目增加和体积减小的现象(图7-3)。该现象被称作线粒体片段化。

Fz0和Mfn的发现及其功能的确定为人类认识线粒体的融合现象提供了重要的分子基础。但目前除在酵母中发现了一个与Fzo1蛋白相结合的膜间隙蛋白(Mgm1)为线粒体融合所必需外,未发现其他与线粒体融合相关的基因和蛋白质。此外,虽然植物细胞中存在频繁的线粒体融合现象,但其基因组中并不存在F20或Mfh的同源基因。

线粒体的分裂同样依赖特定基因和蛋白质的参与和调控。研究发现,无论在动物还是植物细胞中,线粒体的分裂都离不开一类发动蛋白( dynamin)。编码这类蛋白质的基因,如酵母中的Dmm1(编码 dynamin-1)、大鼠中的Dlpl(编码 dynamin-like protein1)、线虫和哺乳动物中的Dp1(编码 dynamin-related protein1)以及植物细胞中的Ad2B(编码 Arabidopsis thaliana dynamin like protein2B)突变均会抑制线粒体的分裂,导致细胞中出现结构异常的大体积线粒体。与介导线粒体融合的基因(Fzo和Mfmn)相比,线粒体分裂必需的发动蛋白类基因不仅在酵母和动物之间呈现同源性,同时也发现于植物基因组中,说明线粒体分裂的分子机制在整个真核生物的演化中具有高度的保守性。 

有趣的是,线粒体分裂必需的发动蛋白类蛋白同样是一类大分子GTP酶。尽管不同类型的大分子GTP酶具有各自的特征性结构,但它们的共性是具有一个相似的GTP酶结构域。除了线粒体的融合与分裂外,这类大分子GTP酶在细胞中还介导各种膜相细胞器的融合与断裂,同时在细胞内膜泡转运的过程中扮演重要的角色。目前,人们已将真核生物基因组中编码大分子GTP酶的所有基因归类为一个基因超家族。该超家族编码的所有大分子GTP酶被统称为发动蛋白相关蛋白( dynamin-related protein)。依照这种新的归类,介导线粒体融合(F20和M)及分裂(Dml、Dll和Dp1)的基因均被列为发动蛋白相关蛋白基因超家族的成员。

线粒体分裂必需的Dnm1、Dlpl和Dp1蛋白结构中没有线粒体膜的定位结构域。这些分子大部分以可溶性蛋白的形式存在于细胞质中。在线粒体分裂时,这类GTP酶分子在其他蛋白的介导下有序地排布到线粒体分裂面的外膜上(图7-4),组装成环线粒体的纤维状结构。该结构与线粒体膜间隙及内膜下的未知蛋白质协同缢缩,致使线粒体膜发生环形内陷并最终一分为二。如果相关基因发生突变,线粒体分裂过程中的膜内陷和膜断裂便会出现障碍由于线粒体分裂相关的发动蛋白不具备膜定位能力,所以如何将它们“招募”到线粒体表面适当位置是线粒体分裂调控分子机制的重要环节。两种线粒体分裂必需的蛋白质—Fi1和Mdv1,在这个环节中发挥着中心的作用。其中Fis1的C端具有线粒体外膜的跨膜结构,保证该蛋白N端朝向细胞质定位于线粒体外膜;而Mdv1同时结合Fis1和Drpl(或Dnm1 Dlp1),以“桥”的方式将Drp1(或Dnm1、Dlp1)定位到线粒体外膜上。除此之外,线粒体分裂还需要endophilin Bl, MFF(mitochondrial fission factor) CA定位到线粒体外膜上。除此之外,线粒体分裂还需要endophilin B1, MFF(mitochondrial fission factor) L'LK GDAPl(ganglioside-induced differentiation associated protein1)等一些蛋白质的参与。其中GDAP1突变还会引起线粒体疾病( Charcot-Marie-Toothe disease type 4A)。可见,线粒体分裂的分子机制非常复杂且与线粒体的功能密切相关。

2.线粒体融合与分裂的结构动力基础

线粒体的融合与分裂都是一个“动”的过程,和细胞内其他的动态行为(如染色体的移动)一样,需要特定的力学机制予以保证。介导线粒体融合与分裂的分子力学机制被称为线粒体的融合与分裂装置fusion and division apparatus)。这些装置实际上是指参与线粒体融合或分裂的所有蛋白质在细胞内组装而成的功能单位。

借助现有的细胞生物学方法观察线粒体融合时,除了发现线粒体融合素家族的GTP酶(Fz0和Min)均匀分布于线粒体外膜之外,人们并未观察到结构上的线粒体融合装置,推测线粒体融合的细胞动力学机制可能比较简单。相比之下,线粒体分裂装置的细胞结构特征则非常突出。借助透射电子显微镜,人们在动植物细胞的线粒体上均发现了环绕线粒体的蛋白质缢缩结构,称为线粒体分裂环( mitochondrial division ring)(图7-5)。线粒体分裂环又分为外环和内环。其中外环位于线粒体外膜的表面,暴露于细胞质;而内环则位于线粒体内膜的下面,暴露在线粒体基质内。在线粒体分裂过程中,以分裂环为主体的线粒体分裂装置呈现有序的动态变化,说明线粒体分裂的细胞动力学机制较为复杂。 

线粒体的分裂表现为线粒体内外膜同时发生内陷并最终在内陷处被分断的过程。这个连续的过程可被人为地分为三个阶段:①早期:线粒体分裂的准备阶段,膜内陷尚未发生;②中期:线粒体膜呈现环形内陷并逐渐加深;③后期:线粒体膜被分断,线粒体一分为二。在线粒体分裂的早期,内环首先形成于线粒体内膜下,随后在线粒体的外膜上面出现外环。当内环和外环分别形成时,线粒体膜上的着环区域开始发生内陷,线粒体分裂进入中期。随着线粒体膜内陷程度的加深,外环不断加粗,而内环始终保持细薄的状态。当线粒体分裂进入后期时,内环消失,外环则一直保留到分裂结束。

目前,线粒体分裂装置(分裂环)的蛋白质基本组成尚不清楚。上面介绍的发动蛋白家族蛋白(Dnml、Dpl或Drp1)只出现于分裂的中期稍后及后期的外环中,推测参与深度缢缩及膜分断,是线粒体分裂外环的重要成分之一。此外,在红藻细胞的线粒体分裂过程中,一种称作FtsZ的大分子GTP酶(原核细胞分裂的必需蛋白)先于内环出现在线粒体内膜下的分裂位置并形成环状分布。但随着线粒体分裂进程的加深,FtSZ蛋白的密度逐渐减小,推测其可能是招募内环蛋白的重要分子。有趣的是,动物及高等植物的基因组中并未发现产物定位于线粒体的FZ同源基因,说明FtsZ蛋白的功能在演化过程中可能被另外的未知蛋白所取代。由于线粒体分裂装置的基本组成以及决定其形成位置的分子机制还不得而知,线粒体分裂在今后段时期内仍将是细胞生物学中令人关注的重要领域之一。

3.线粒体融合与分裂的生物学意义

线粒体在细胞内发生融合和分裂的现象发现已久,但该现象的生物学意义尚待解析。一般认为,线粒体的基质中含有高水平的氧化自由基,容易导致DNA损伤。因此,线粒体可能通过不断的融合和分裂来平衡这种损伤,以保证部分遗传物质受损的线粒体可以正常工作。除此之外,线粒体的融合与分裂显然也是线粒体大小、数目及分布调控的基础。拟南芥根尖分生细胞中存在伴随细胞周期的线粒体融合与分裂:在有丝分裂的G2期,细胞内大量的颗粒状线粒体融合形成巨大的线粒体片层,环绕在细胞核周围;之后这种大片层状线粒体再度分裂,形成颗粒状线粒体,分散到细胞质中。这种规律性的线粒体融合与分裂可能是一种细胞调控,使线粒体的数量、大小和分布变化更有效地对应细胞内的能量需求与供给。 

最近的研究发现,植物体细胞中的线粒体数目远大于细胞中的线粒体DNA拷贝数。比如,拟南芥的叶肉细胞拥有500-1000个线粒体,而每个细胞中却只存在50~70个线粒体DNA拷贝(测序结果展示的3669kb全长环形DNA分子为1个拷贝)。这个结果说明植物细胞中多个线粒体共享1个线粒体DNA分子。

进一步的显微成像结果表明,拟南芥叶肉细胞中多数的线粒体并不携带线粒体DNA,而部分携带DNA的线粒体也只携带100kb(约13个拷贝)左右的DNA分子(图7-6)。因此,植物细胞中的线粒体遗传信息在线粒体之间呈现出显著的不均等分布,需要依赖频繁的线粒体融合与分裂实现遗传信息的共享。同时,上面的结果还表明,植物线粒体DNA测序获得的全长DNA分子序列可能是人为拼接的结果,而实际存在于线粒体中的DNA分子则可能是该序列的不同的组成部分。 

二、线粒体的超微结构

虽然线粒体的形态和大小表现出多种变化,但其基本结构均由内外两层单位膜封闭包裹而成。线粒体的外膜( outer membrane)平展,起界膜作用;而内膜( Inner membrane)则向内折叠延伸形成嵴( cristae)。在不同的真核生物中,线粒体嵴的形态也呈现丰富的变化。比如,动物细胞中常见的“袋状嵴”是由内膜规则性折叠而成,而植物细胞线粒体的“管状嵴”则是内膜不规则内陷形成的弯曲小管(图7-7)等。

存在于外膜和内膜之间的空间被称为膜间隙Intermembrane space)。通常情况下,膜间隙的宽度比较稳定。线粒体内膜之内空间称之为基质( matrix)(图7-7C)。近年来的研究发现,线粒体外膜与内质网或细胞骨架等其他细胞组分之间可以通过特定的蛋白质形成结构和功能的联系,而线粒体内膜与外膜之间也由一些蛋白质形成随机的点状连接。 

(一)外膜

外膜指线粒体最外面的一层平滑的单位膜结构,厚约6mm。外膜中蛋白质和脂质约各占50%。外膜上分布着由孔蛋白(poin)构成的桶状通道,直径为2~3m,可根据细胞的状态可逆性地开闭。当孔蛋白通道完全打开时,可以通过分子量高达5000的分子。ATP、NAD、辅酶A等分子量小于1000的物质均可自由通过外膜。由于外膜的通透性很高,膜间隙中的离子环境几乎与胞质相同。

外膜上还分布有一些特殊的酶类,如参与肾上腺素氧化、色氨酸降解、脂肪酸链延长的酶,表明外膜不仅参与膜磷脂的合成,还可对将在线粒体基质中彻底氧化的物质进行先行初步分解。外膜的标志酶是单胺氧化酶(monoamine oxidase)。 

(二)内膜

内膜是位于外膜内侧的一层单位膜结构,厚6~8nm。相对外膜而言,内膜有很高的蛋白质/脂质比(质量比≥3:1)。内膜缺乏胆固醇,富含心磷脂( cardiolipin,约占磷脂含量的20%)。这种组成决定了内膜的不透性( impermeability),限制所有分子和离子的自由通过,是质子电化学梯度的建立及ATP合成所必需的。细菌的质膜也具有线粒体内膜的结构特征,推测线粒体内膜与细菌质膜具有演化上的关联性。

线粒体内膜向内延伸形成嵴,大大增加了内膜的面积。据测算,肝细胞线粒体内膜的面积相当于外膜的5倍,细胞质膜的17倍。同时,嵴的形状、数量和排列与细胞种类及生理状况密切相关,如心肌和骨骼肌线粒体嵴的数量相当于肝细胞线粒体嵴的3倍。这种差异可能反映了不同组织细胞对ATP的需求。通常情况下,能量需求较多的细胞中线粒体嵴的数量也较多。

线粒体内膜是氧化磷酸化的关键场所。早期的研究发现内膜的嵴上存在许多规则排列的颗粒,称为线粒体基粒( elementary particle)。实验证明这些颗粒即为ATP合酶( ATP synthase)(图7-8)。内膜的标志酶是细胞色素氧化酶。

(三)膜间隙

膜间隙的宽度通常维持在6~8nm。当细胞活跃呼吸时,膜间隙可显著扩大。膜间隙内的液态介质含有可溶性的酶、底物和辅助因子。腺苷酸激酶是膜间隙的标志酶,其功能为催化ATP分子末端磷酸基团转移到AMP,生成ADP。 

(四)线粒体基质

线粒体基质为富含可溶性蛋白的胶状物质,具有特定的pH和渗透压,催化线粒体重要生化反应,如三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等相关的酶类存在于基质中。此外,基质中还含有DNA、RNA、核糖体以及转录、翻译所必需的重要生物大分子。

从上述结构特征可以看出,线粒体的固形成分主要为蛋白质和脂质。其中脂质占线粒体干重的20%~30%,而蛋白质中包括了催化线粒体生化反应的主要酶类。

三、氧化磷酸化

线粒体的主要功能是高效地将有机物中储存的能量转换为细胞生命活动的直接能源ATP。人体内的细胞每天要合成数千克ATP,大 约95%由线粒体产生。因此,线粒体被誉为细胞的“动力工厂”( power plant)。线粒体通过氧化磷酸化作用进行能量转换,其内膜上的ATP合酶、电子传递及内膜本身的理化特性为氧化磷酸化提供了必需的保障。

(一)ATP合酶

在线粒体中,最终生成ATP的装置是ATP合酶。在电子显微镜下,ATP合酶的分子由球形的头部和柱形的基部组成,头部朝向线粒体基质,规则性地排布在内膜下并以基部与内膜相连(图7-8A)。由于电子密度的差别不明显,尽管ATP合酶头部的直径达到了9mm,在常规透射电镜的线粒体超薄切片上仍难以分辨,须借助负染色电镜技术。 J. T. Stasny和F.L. Crane于1964年分离了线粒体内膜,用超声波处理成“亚线粒体小泡”后,利用负染技术成功地观察到了ATP合酶的分布及分子构型,为后续的线粒体功能研究提供了珍贵的初始资料。

由于ATP合酶在ATP生成中处于重要地位,其分子结构与分子动力学机制一直是线粒体研究的重要组成部分。在生化研究中,ATP合酶的头部被称为偶联因子1( coupling factor1,F1),由5种类型的9个亚基组成组分为a3B3e。在空间上,3个a亚基和3个β亚基交替排列,形成一个“橘瓣”状结构(图7-8B)。其中a和β亚基具有核苷酸结合位点,但只有B亚基的结合位点具有催化ATP合成或水解的活性。F1的功能是催化ATP合成,在缺乏质子梯度情况下则呈现水解ATP的活性。γ亚基的一个结构域构成穿过F1的中央轴,另结构域与3个B亚基中的一个结合。ε亚基协助y亚基附着到ATP合酶的基部结构F上。y与E亚基具有很强的亲和力,结合形成“转子”( rotor),旋转于a3B3的中央,调节3个β亚基催化位点的开放和关闭。δ亚基为F1和F。相连接所必需。 

ATP合酶的基部结构被称作F。[表示对寡酶素( oligomycin)敏感的因子1。与亲水性的F1相比,F是一个疏水性的蛋白复合体,嵌合于线粒体内膜,由a、b、c3种亚基按照abc=15的比例组成跨膜的质子通道。多拷贝的c亚基形成一个环状结构。a亚基和b亚基形成的二聚体排列在c亚基十二聚体形成的环的外侧。同时,a亚基、b亚基及F1的δ亚基共同组成“定子”( stator),也称外周柄在线粒体ATP合酶的分子中,F1和F通过“定子”和“转子”的双重作用形成连接。合成或水解ATP时,“转子”受到通过F的H流驱动,于ax3B3的中央旋转,依次与3个β亚基作用,调节β亚基催化位点的构象变化;“定子”在一侧将α3B3与F连接起来并使之保持固定的位置。因此,F在ATP合酶中的作用是将跨膜质子驱动力转换成扭力矩( torsion),驱动“转子”旋转。

基于ATP合酶的分子结构, Boyer于1979年提出了结合变构机制( binding change mechanisn),以解释质子流驱动ATP合成的分子过程。该机制认为:①质子梯度的作用并不是生成ATP,而是使ATP从酶分子上解脱下来。②ATP合酶上的3个阝亚基的氨基酸序列是相同的,但它们的构象却不同。即在任一时刻,3个β催化亚基以3种不同的构象存在,从而使它们对核苷酸具有不同的亲和性(图7-9)。③ATP通过旋转催化( rotational catalysis)而生成。在此过程中,通过F。“通道”的质子流引起c亚基环和附着于其上的γ亚基纵轴(中央轴)在a3B3的中央进行旋转。旋转的动力来自于F。质子通道中的质子跨膜运动。由于在外侧有“定子”(外周柄)的固定作用,合酶的外周部分相对于膜表面是静止的。“转子”的旋转在360°范围内分三步发生大约每旋转120°,Y亚基就会与一个不同的β亚基相接触。这种接触迫使β亚基转变成β-空缺构象。γ亚基的次完整旋转(360°)必然使每一个β亚基都经历三种不同的构象改变,导致3个ATP生成并从酶表面释放。ATP合酶中使化学能转换成机械能的效率几乎达100%,是迄今发现的自然界最小的“分子马达”。 

(二)质子驱动力

线粒体ATP合酶在质子流的推动下实现分子内转子”的旋转,驱动ATP的生成。依照这个模型,线粒体膜间隙中的质子浓度必须高于基质中的质子浓度,才有可能产生质子的定向流动。也就是说,膜间隙与基质之间质子浓度梯度的形成与保持是线粒体合成ATP的基本前提。

研究结果表明,线粒体内膜上的电子传递为膜间隙与基质之间的质子梯度提供了保证。在电子传递的过程中,高能电子的能量逐级释放,基质中的质子则借助高能电子释放的能量被不断地定向转运到膜间隙。

这个过程所需的H和高能电子来源于线粒体内的三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA循环)。其产物NADH在NADH脱氢酶作用下脱氢形成H和高能电子(NADH→NAD+H+2e)(图7-10)。可见线粒体承担的能量转换实质上是把基于质子密度梯度(pH差)的质子驱动力( proton motive force)转换为ATP分子中的高能磷酸键。因此,来源于TCA循环的高能电子是线粒体合成ATP的基本能源,而电子传递过程承担了重要的介导作用。

经过电子传递,高能电子携带的能量被逐级卸载成为低能电子。由于低能电子最终被O2分子接收,生成H2O(图7-10),所以电子传递的化学本质相当于一个氧化反应。ATP合成过程中的磷酸化(ADP+Pi→ATP)反应不仅以电子传递为基础,而且与之偶联发生,因此线粒体中ATP的形成过程也被称为氧化磷酸化( oxidative phosphorylation)。这个过程不仅基于线粒体内膜上的电子传递和ATP合酶,同时依赖于线粒体内膜的物理特性。

由于O2分子获得电子生成水时只接受低能电子所以电子传递实际上是一个高能电子释放多余能量的自然过程,同时质子的转运恰好利用了该过程释放的能量,因此电子传递不需要额外能量的驱使。 

(三)电子传递链

化学和分子生物学实验的结果表明,高能电子释放多余能量的过程是分级分步完成的。在电子传递的每个能级上,接受和释放电子的分子或原子被称为电子载体( electron carrier),而由电子载体组成的电子传递序列被称为电子传递链( electron transport chain),也称作呼吸链(respiratory chain)。 

参与电子传递链的电子载体有5类:黄素蛋白、细胞色素、泛醌、铁硫蛋白和铜原子。它们的共同特征是具有氧化还原作用。

实验证明,呼吸链中的电子载体按严格的顺序和方向排列,规律为氧化还原电位由低向高。其中NAD+/NADH的氧化还原电位值最低(E‘=-0.32V),而O2/H2O的氧化还原电位最高(E’0=+0.82V)。这种渐高的排序是因为氧化还原电位较低的电子载体具有较强的电子提供能力,因而较容易作为还原剂而处于传递链的面位置。在呼吸链中,一个电子载体从前面一个电子载体上获得电子而被还原,随后将电子传递给下一个载体而被氧化,周而复始。 

(四)电子传递复合物

除了上面的电子载体以外,线粒体内膜上的电子传递还需要与这些载体分子互作的蛋白质及多肽参与。将线粒体内膜破坏后,可从中分离出4种膜蛋白复合物分别命名为复合物I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。实验证明,每种复合物催化电子在呼吸链中的一段传递。如:复合物I和Ⅱ分别催化电子从供体NADH和FADH2传递到泛醌(UQ);复合物Ⅲ催化电子从泛醌传递到细胞色素c(Cytc);复合物Ⅳ将电子从Cytc转移到O2。这样,完整的电子传递由上述4种膜蛋白复合物分段催化完成(图7-11)。这些分布于线粒体内膜、含有电子传递催化中心的膜蛋白复合物被称作电子传递复合物。

膜蛋白复合物的分子解析结果表明,哺乳动物的4个电子传递复合物包含了约70种不同的蛋白质或多肽。其中一部分多肽并不参与电子传递,可能贡献于复合物的结构或构型。 

(1)复合物1亦称NADH-CoQ还原酶或NADH脱氢酶。哺乳动物的复合物I由42个不同的多肽组成总分子质量接近1000kDa。其中7个疏水的跨膜多肽由线粒体基因编码。复合物I含一个带有FMN的黄素蛋白和至少6个铁硫中心。高分辨率电镜显示复合物Ⅰ呈L形,一侧臂嵌于膜上,另一侧臂伸至基质。后者催化1对电子从NADH传递给泛醌。复合物1每传递1对电子伴随4个质子从基质转移到膜间隙,可理解为一种由高能电子释放能量驱动的质子泵。

(2)复合物Ⅱ亦称琥珀酸-CoQ还原酶或琥珀酸脱氢酶,由4种不同的蛋白质组成,总分子质量为140kDa。复合物Ⅱ是三羧酸循环中唯一一个结合在膜上的酶,催化来自琥珀酸的1对电子经FAD和Fe-S传给泛醌而进入呼吸链。该步电子传递释放的能量较少不伴随质子的跨膜转移。

(3)复合物Ⅲ亦称 CoQ-Cyt c还原酶、细胞色素还原酶或 Cyt bo1复合物(简称bc1),由10个多肽组成,总分子质量为250kDa。该复合物含1个Cytb(线粒体基因编码)、1个Cytc1和1个铁硫蛋白,催化电子从泛醌传给Cytc。复合物Ⅲ每传递1对电子伴随4个质子从基质转移到膜间隙。 

(4)复合物Ⅳ亦称细胞色素氧化酶或Cytc氧化酶。哺乳动物的复合物Ⅳ由13个多肽组成,总分子质量约为204kDa。其中3个疏水性多肽由线粒体基因编码。该复合物共有4个氧化还原中心:Cyta、Cyta3及2个铜离子(CuA,CuB),催化电子从Cytc传给氧,生成H2O。复合物Ⅳ每传递1对电子从基质中摄取4个H,其中2个用于水的形成,另2个被转移至膜间隙。 

四、线粒体与疾病

作为一种半自主性细胞器,线粒体的氧化磷酸化DNA复制、RNA转录、蛋白质合成等生命活动据推测需要多达1000~200种蛋白质。目前已经确定在线粒体中发挥功能的蛋白质有近900种,其余的有待进一步探究。如果编码这些蛋白质的基因发生了有害的突变,蛋白质的功能就有可能受到影响甚至丧失。在这种情况下,线粒体的生命活动可能出现障碍,导致动植物机体发生疾病。在医学上,由线粒体功能障碍引起的疾病被称为线粒体病( mitochondrial disease)。

已知的人类线粒体病有100多种,常见的有脑坏死、心肌病、肿瘤、不育、帕金森综合征等。由于肌肉、心脏和大脑等组织需要线粒体提供相对大量的能量供给,线粒体病的症状较多地表现为这些组织的异常病变。例如,曾经在我国一部分地区高发的克山病就是一种心肌线粒体病。它是以心肌损伤为主要病变的地方性心肌病,因缺硒而引起。由于硒对线粒体膜具有不可替代的稳定作用,缺硒的患者心肌线粒体出现膨胀,嵴稀少且不完整,膜电位下降,膜流动性减低。同时,患者线粒体中的琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶和ATP合酶活性都有明显降低,导致电子传递和氧化磷酸化偶联的效率受到显著影响。

线粒体中许多功能蛋白复合物(如ATP合酶、电子传递复合物)是由线粒体基因和核基因编码的蛋白质亚基共同组成的。因此,线粒体病既有可能来源于线粒体DNA的突变,也有可能来源于核DNA的突变。此外,线粒体内的化学反应呈链式进行(如电子传递链),催化不同环节的酶类缺失或缺陷往往导致类似的线粒体功能障碍。这样,即使症状非常类似的线粒体病,在不同的患者中也有可能来源于不同的基因突变。例如,常见的 Leigh综合征(亚急性坏死性脑脊髓病)既有可能由线粒体编码的基因突变引起,也可能由细胞核编码的其他多个基因突变造成。区别线粒体病致病基因核一质性质的简单方法是分析病症的遗传规律。线粒体DNA(基因)突变导致的线粒体病呈单纯的母系遗传。

人类的线粒体基因组只编码13种蛋白质,约相当于线粒体生命活动所需蛋白质总数的1%。但已知的线粒体病的绝大多数来源于线粒体基因组编码的蛋白质缺失或缺陷,表明线粒体DNA发生突变的频率远高于细胞核DNA。出现这样的现象可能与呼吸链产生的自由基相关。据测算,机体95%以上的氧自由基来自线粒体的呼吸链。正常情况下氧自由基可被线粒体中的Mn2-SOD(超氧化物歧化酶)清除。但机体衰老及退行性疾病时Mn-SOD活性降低,导致线粒体中氧自由基积累。实验结果表明,氧自由基的过度积累导致线粒体DNA的损伤或突变。

植物的线粒体基因组编码较多的蛋白质(如拟南芥线粒体DNA编码122种蛋白质)。虽然这些蛋白质的变异同样导致个体缺陷,但植物材料中很少使用线粒体病的概念。农业生产中广为利用的细胞质雄性不育,事实上是一种典型的植物线粒体病。由于该性状具有极高的生产利用价值,其分子机制的研究受到了国内外长期和广泛的关注。中国科学家刘耀光的研究组2006年首先破解了水稻细胞质雄性不育及其恢复的机制,他们发现了线粒体DNA特定部位重组产生编码毒性多肽的可读框(O79),其产物在花粉线粒体中的积累导致雄性不育的规律;同时,研究还发现了恢复系中R/a和R/b基因编码核酶,通过降解Or79mRNA的方式解除花粉败育的不育系恢复机制。 

本节着重介绍了线粒体在真核细胞能量代谢中的重要作用。事实上,除了氧化磷酸化产生ATP以外,线粒体还参与许多其他非常重要的生命活动过程,如细胞氧化还原电位的调节、信号转导、细胞凋亡以及细胞电解质平衡等。相关内容见本教材的其他章节。