第一节 核被膜
核被膜( nuclear envelope)位于细胞核的最外层，是细胞核与细胞质之间的界膜。特殊的位置决定了它具有两方面的功能。一方面，核被膜构成了核、质之间的天然选择性屏障，将细胞分成核与质两大结构和功能区域，使得DNA复制、RNA转录与加工在核内进行，而蛋白质翻译则局限在细胞质中。这样既避免了核质间彼此相互干扰，使细胞的生命活动秩序更加井然，同时还能保护核内的DNA分子免受损伤。另一方面，核被膜调控细胞核内外的物质交换和信息交流。核被膜并不是完全封闭的，核质之间进行着频繁的物质交换与信息交流。这些物质交换与信息交流主要是通过核被膜上的核孔复合体进行的。
核被膜在普通光学显微镜下难以分辨；在相差显微镜下，由于细胞核与细胞质的折光率不同，可以看出核被膜的界限；只有在电子显微镜下才能看清核被膜的细微结构。核被膜主要有三种结构组分：双层核膜、核孔复合体与核纤层(图9-1)。核纤层( nuclear lamina)紧贴内层核膜下，是一层由纤维蛋白构成的网络结构，它与胞质中间丝、核基质有密切联系。当真核细胞用非离子去垢剂、核酸酶及高盐溶液等分级抽提后，核纤层往往与核孔复合体、胞质中间丝、核基质一起被保存下来，成为贯穿于细胞核与细胞质的骨架结构体系
一、核膜
(一)核膜结构
核膜由内外两层平行但不连续的单位膜构成。面向核质的一层膜称作内(层)核膜( inner nuclearmembrane)，而面向胞质的另一层膜称为外(层)核膜( outer nuclear membrane)。两层膜厚度相同，约为7.5m。
两层膜之间有20~40nm的透明空隙，称为核周间隙( perinuclear space)或核周池( perinuclear cisternae)。核周间隙宽度随细胞种类不同而异，并随细胞的功能状态而改变。内、外核膜各有特点：①外核膜表面常附有核糖体颗粒，且常常与糙面内质网相连，使核周间隙与内质网腔彼此相通。从这种结构上的联系出发，外核膜可以被看做是糙面内质网的一个特化区域。②内核膜表面光滑，无核糖体颗粒附着，但紧贴其内表面有一层致密的纤维网络结构，即核纤层。内核膜上有一些特有的蛋白质成分，如核纤层蛋白B受体( amin B receptor， LBR)。
双层核膜互相平行但并不连续，内外核膜常常在某些部位相互融合形成环状开口，称为核孔( nuclear pore)。在核孔上镶嵌着一种复杂的结构，叫做核孔复合体( nuclear pore complex，NPC)。核孔周围的核膜特称为孔膜区( pore membrane domain)，它也有一些特有的蛋白质成分，如核孔复合体特有的跨膜糖蛋白gp210、Pom121等。
(二)核膜的崩解与组装
在真核细胞中，核膜伴随着细胞周期的进行有规律地解体与重建。在分裂期，双层核膜崩解成单层膜泡，核孔复合体解体，核纤层解聚；到分裂末期，核被」膜开始围绕染色体重新形成。那么，子细胞的核被膜是来源于旧核被膜碎片，还是来自其他膜结构?对此一直存在两种意见。通过对变形虫的研究，很多人支持第一种说法，即新核膜来自旧核膜。将变形虫培养在含有H-胆碱的培养基中，H-胆碱掺入到膜脂的磷脂酰胆碱中，这样核膜便被标记。将带有放射性标记的核取出，移植到正常的去核变形虫中，追踪观察一个细胞周期，结果发现子代细胞形成后，原有的放射性标记全部平均分配到子细胞的核被膜中，说明旧核膜参与了新核膜的构建。
对于核膜组装的机制及其与核孔复合体、核纤层的关系，目前尚无定论。一种以非洲爪蟾( Xenopus laevis)卵提取物为基础的非细胞核组装体系(cel-free nuclear assembly system)为研究该问题提供了很好的实验模型。非洲爪蟾的成熟卵母细胞处于第二次减数分裂中期。此时的卵母细胞体积很大，直径可达1mm，其中储存了大量的营养物质，为受精后快速卵裂做准备。一个成熟的卵母细胞所储备的原料可供形成103~104个细胞核。现已设法用这种卵提取物在体外成功地模拟出细胞核的构建及解体过程。目前越来越多的证据表明，一种直径200mm左右的单层小膜泡直接参与了核膜的形成。它们首先附着到染色质表面，在染色质表面排列并相互融合形成双层核膜，同时在膜上的某些部位内外膜相互融合并形成核孔复合体结构。对HeLa细胞有丝分裂过程的研究发现，核被膜在细胞周期中发生有序的去组装与重组装。从处于分裂期的HeLa细胞中可以分离出两种膜泡组分：一组富含LBR，另一组富含p210。这说明核被膜的去组装不是随机的，而是具有区域特异性( domain- specific)。在有丝分裂后期核被膜重新组装时，富含LBR的膜泡首先与染色质结合，而富含gp210的膜泡与染色质结合较晚。近期的硏究工作发现， Ran gtp酶及其结合蛋白参与了核被膜的组装调控。这些蛋白质不仅调控膜泡在染色质表面的募集，也参与膜泡的融合和核孔复合体组装。此外，核被膜的去组装、重组装变化受细胞周期调控因子的调节，这种调节作用可能通过对核纤层蛋白、核孔复合体蛋白等进行磷酸化与去磷酸化修饰来实现。
二、核孔复合体
19491950年间，H.G. Callan与S.G. Tomlin在用透射电子显微镜观察两栖类卵母细胞的核被膜时发现了核孔。随后人们逐渐认识到核孔并不是一个简单的孔洞，而是一个相对独立的复杂结构。1959年M.L. Watson将这种结构命名为核孔复合体。迄今已知的所有真核细胞，从酵母到人，其间期细胞核普遍存在核孔复合体。
核孔复合体在核被膜上的数量、分布密度与分布形式随细胞类型、细胞核的功能状态的不同而有很大的差异般来说，转录功能活跃的细胞，其核孔复合体数量较多。一个典型的哺乳动物细胞核被膜上的核孔复合体总数为3000-4000个，相当于10~20个/m2。
(一)结构模型
核孔复合体镶嵌在内外核膜融合形成的核孔上。核孔的直径为80~120nm，而核孔复合体稍大一些，直径为120~150mm，因为它有一部分结构嵌入核被膜内。有关核孔复合体的结构一直是一个令人感兴趣的问题。自从被发现以来，不断有新的结构模型提出，但至今并不完善，仍有一些关键性的问题有待阐明。这主要是因为分离纯化核孔复合体的方法还不够完善，并且还受到电镜制样技术与观察方法的限制。研究核孔复合体形态结构的经典方法主要有三种：树脂包埋超薄切片技术、负染色技术和冷冻蚀刻技术。20世纪80年代以来，计算机图像处理技术应用于电镜的图像分析，高分辨率场发射扫描电镜技术(HR- FESEM)和快速冷冻一冷冻干燥制样技术的发展，使人们对核孔复合体的形态结构有了更深入的了解(图9-2)。综合已有的资料人们提出了一个最新的核孔复合体结构模型
(图9-3)。
对于这个模型的结构组成目前有两种理解：①从横向上看，核孔复合体由周边向核孔中心依次可分为环、辐、栓三种结构亚基。②从纵向上看，核孔复合体由核外(胞质面)向核内(核质面)依次可分为胞质环、辐(+栓)、核质环三种结构亚基，形成“三明治”( sandwich)式的结构。综合起来，核孔复合体主要有以下4种结构组分：①胞质环( cytoplasmic ring)：位于核孔边缘的胞质面一侧，又称外环。环上有8条短纤维对称分布并伸向胞质。②核质环( nuclear ring)：位于核孔边缘的核质面一侧，又称内环。内环比外环结构复杂，环上也对称地连有8条细长的纤维，向核内伸入50-70mm。在纤维的未端形成一个直径为60mm的小环，小环由8个颗粒构成。这样整个核质环就像一个“捕鱼笼”(fsh-rap)样的结构，也有人称之为核篮( nuclear basket)结构。③辐( spoke)：由核孔边缘伸向中心，呈辐射状八重对称。它的结构也比较复杂，可进一步分为三个结构域：主要的区域位于核孔边缘，连接内、外环，起支撑作用，称作“柱状亚基”( column subunit)；在这个结构域之外，接触核膜部分的区域称为“腔内亚基”( luminal subunit)，它穿过核膜伸入双层核膜的核周间隙；在“柱状亚基”之内，靠近核孔复合体中心的部分称作“环带亚基”( annular subunit)，由8个颗粒状结构环绕形成核孔复合体核质交换的通道。④栓：或称中央栓( central plug)，位于核孔的中心，呈颗粒状或棒状，所以又称为中央颗粒( central
granule)。由于推测它在核质交换中起一定的作用，所以也把它叫做“ transporter”。不过不是在所有的核孔复合体中都能观察到这种结构，因此有人认为它不是核孔复合体的结构组分，而只是正在通过核孔复合体的被转运的物质。由上述结构模型可见，核孔复合体相对于垂直于核膜通过核孔中心的轴呈辐射状八重对称结构，而相对于平行于核膜的平面则是不对称的，即核孔复合体在核质面与胞质面两侧的结构明显不对称，这与其在功能上的不对称性是一致的。
Ris与M. Malecki运用HR- FESEM观察非洲爪蟾卵母细胞核膜上的核孔复合体，发现“捕鱼笼”并非中断且游离在核质中，而是与一种称为“ cable”的网络通道相连通。这种 cable由与“捕鱼笼”类似的结构单位串联而成，看上去像是“捕鱼笼”上的纤维与小环在核质中的周期性重复与延续。从“捕鱼笼”末端小环的8个颗粒上又发出8条细长的纤维，在纤维上周期性地间隔有8个颗粒构成的环状结构。不同的“捕鱼笼”发出的 cable相互交叉，使 cable成为一个遍布核质、相互贯通的复杂的网络。这种与“捕鱼笼”相连、结构相似的cable有何功能尚不清楚，推测它很可能与核孔复合体的核质转运功能有关(二)组成成分
核孔复合体主要由蛋白质构成，其总分子质量约为125MDa，新近推测可能含有30余种不同的多肽，共1000多个蛋白质分子。通过生化与遗传学技术相结合，在酵母中已鉴定出30余种与核孔复合体有关的蛋白质成分。迄今已鉴定的脊椎动物的核孔复合体蛋白质成分也已达到10多种(表9-1)，其中gp210与p62是最具有代表性的两个成分，它们分别代表着核孔复合体蛋白的两种类型。实际上，核孔复合体的整个结构在演化上是高度保守的。gp210与p62这两类蛋白质成分在从酵母到人的多种生物中都已被发现证实，它们在不同的物种中有很强的同源性。目前人们倾向于把所有的核孔复合体蛋白统一命名为“核孔蛋白”( nucleoporin， Nup)。
gp210代表一类结构性跨膜蛋白，是第一个被鉴定出来的核孔复合体蛋白，分子质量为210kDa，位于核膜的“孔膜区”，故认为它在锚定核孔复合体的结构上起重要作用。目前认为g210主要有三方面的功能：①介导核孔复合体与核膜的连接，将核孔复合体锚定在“孔膜区”，从而为核孔复合体组装提供一个起始位点。②在内、外核膜融合形成核孔中起重要作用。③在核孔复合体的核质交换功能活动中起一定作用，如g210核周间隙内肽段的抗体能够降低蛋白质入核转运的速度。
p62代表一类功能性的核孔复合体蛋白。脊椎动物的p62分子主要分为两个结构域：①疏水性N端区：具有FXFG(F：苯丙氨酸；X：任意氨基酸；G：甘氨酸)形式的重复序列，这个区域可能在核孔复合体功能活动中直接参与核质交换。②C端区：具有疏水性的七肽重复序列，类似一些纤维蛋白(如中间丝蛋白、核纤层蛋白)的杆状区，适合形成α螺旋。这个区域可能通过卷曲螺旋与其他核孔复合体蛋白成分相互作用，从而将p62分子稳定到核孔复合体上，为其N端进行核质交换活动提供支持。p62对核孔复合体行使正常的功能非常重要。目前，这一类核孔复合体蛋白成分已有很多被鉴定出来，其中有些像p62一样带有O-连接 GIcNac类型的糖基化修饰，并且含有一些重复序列，如Nup153中的FXFG，Nup98中的GLFG(L：亮氨酸)，也有些没有任何糖基化修饰或类似的重复序列
(三)功能
从功能上讲，核孔复合体可以看做是一种特殊的跨膜运输蛋白复合体，并且是一个双功能、双向性的亲水性核质交换通道。双功能表现在它有两种运输方式：被动扩散与主动运输。双向性表现在既介导蛋白质的入核转运，又介导RNA、核糖核蛋白颗粒(RNP)的出核转运(图9-4)。
1.通过核孔复合体的被动扩散
核孔复合体作为被动扩散的亲水通道，其有效直径为9-10nm，有的可达12.5m，即离子、小分子以及直径在10mm以下的物质原则上可以自由通过。对于球形蛋白质，这种有效直径相当于允许分子质量在40~60kDa的蛋白质分子自由穿过核孔。但实际上并不是所有符合这个条件的蛋白质都可以随意出入细胞核有许多小分子的蛋白质，如组蛋白H1，其分子质量虽只有21kDa，但由于它本身带有具信号功能的氨基酸序列，所以是通过主动运输进入细胞核的；有的小分子蛋白质本身虽然没有信号序列，但可以与其他有信号序列的成分结合，一起被主动运输到核内。因此，核孔复合体的这种被动扩散通道并不意味着所有10m以下的小分子在核被膜两侧就一定均匀分布。有些小分子蛋白质可能会因为与其他大分子相结合，或与一些不溶性结构成分(如中间丝、核基质)结合而被限制在细胞质或细胞核内。
2.核孔复合体的主动运输
生物大分子的核质分配如亲核蛋白的核输入，RNA分子及核糖核蛋白颗粒(RNP)的核输出，在细胞核功能活性的控制中起非常重要的作用。对于真核细胞来说，典型的哺乳类细胞的核被膜上有3000-4000个核孔(10-20个和m2)。如果细胞正在合成DNA，为了确保染色质包装，则需要每3min从细胞质向核内输入10°个组蛋白分子，这意味着每个核孔每分钟要运进100个组蛋白分子。如果细胞在迅速生长，则需要每个核孔每分钟从细胞核向细胞质输出3对核糖体大小亚基，以确保蛋白质合成的需要。现在已知，这种大分子的核质分配主要是通过核孔复合体的主动运输完成的，具有高度的选择性，并且是双向的。其主动运输的选择性表现在以下三个方面：①对运输颗粒大小的限制。主动运输的功能直径比被动运输大，为10~20m，甚至可达26nm像核糖体亚基那样大的RNP也可以通过核孔复合体从核内运输到细胞质中，表明核孔复合体的有效直径的大小是可调节的。②通过核孔复合体的主动运输是一个信号识别与载体介导的过程，需要消耗ATP能量，并表现出饱和动力学特征。③通过核孔复合体的主动运输具有双向性，即核输入与核输出，它既能把复制、转录、染色体构建和核糖体亚基组装等所需要的各种因子如DNA聚合酶、RNA聚合酶、组蛋白、核糖体蛋白等运输到核内；同时又能将翻译所需的RNA、组装好的核糖体亚基从核内运送到细胞质。有些蛋白质或RNA分子甚至两次或多次穿越核孔复合体，如核糖体蛋白、 SORNA。
近期对于亲核蛋白的入核转运机制的研究进展较快。亲核蛋白( karyophilic protein)是指在细胞质内合成后，需要或能够进入细胞核内发挥功能的一类蛋白质。大多数的亲核蛋白往往在一个细胞周期中一次性地被转运到核内，并一直停留在核内行使功能，典型的如组蛋白、核纤层蛋白；但也有一些亲核蛋白需要穿梭于核质之间进行功能活动，如核输入蛋白( Importin)。通过研究核质蛋白( nucleoplasmin)的入核转运，人们逐步发现了指导亲核蛋白入核的信号。亲核蛋白一般都含有特殊的氨基酸序列，这些内含的特殊短肽保证了整个蛋白质能够通过核孔复合体被转运到细胞核内。这段具有“定向”“定位”作用的序列被命名为核定位序列( nuclear localization sequence)或核定位信号( nuclear localization signal， NLS)
第一个被确定序列的NLS来自猴肾病毒(SV40)的T抗原(分子质量92kDa)。这个NLS由7个氨基酸残基构成：Pro-Lys-Lys-Iys-Arg-Iys-Val。其中仅一个氨基酸残基的突变就会导致该蛋白在胞质内不正常积累。如果将这段NLS序列连接到非亲核蛋白上，则非亲核蛋白就会被转运到核内。此后，又陆续鉴定出一些其他亲核蛋白的NLS。目前认为NLS是存在于亲核蛋白内的一些短的氨基酸序列片段，富含碱性氨基酸残基，如Lys、Arg，此外还常常含有Pro。这些氨基酸残基片段可以是一段连续的序列，如上述SV40T抗原的NLS；也有分成两段存在于亲核蛋白的氨基酸序列中，两段之间往往间隔约10个氨基酸残基，如核质蛋白的NLS。在不同的NLS之间尚未发现共有的特征序列。与指导蛋白质跨膜运输的信号肽不同，NLS序列可存在于亲核蛋白的不同部位，并且在指导亲核蛋白完成核输入后并不被切除。
亲核蛋白通过核孔复合体的转运是分步进行的，根据整个过程对能量的需求可粗略分为两步：结合( binding)与转移( translocation)。亲核蛋白首先结合到核孔复合体的胞质面，这一步不需要能量，但依赖正常的NLS；随后的转移步骤则需要GTP水解供能。亲核蛋白除了本身具有NLS外，其入核转运还需要一些胞质蛋白因子的帮助。目前比较确定的因子有 Importin-aimportin-B、Ran和NTF2等。在它们的参与下，亲核蛋白的入核转运可分为如下几个步骤(图9-5)：①亲核蛋白通过NLS识别 Importin-x，与可溶性NLS受体Importin-a/ improtin-P异二聚体结合，形成转运复合物。
②在 Importin-β的介导下，转运复合物与核孔复合体的胞质纤维结合。③转运复合物通过改变构象的核孔复合体从胞质面被转移到核质面。④转运复合物在核质面与Ran-GTP结合，并导致复合物解离，亲核蛋白释放。
③受体的亚基与结合的Ran返回胞质，在胞质内Ran GTP水解形成Ran-GDP并与 Importin解离，Ran GDP返回核内再转换成Ran-GTP状态。
对于RNA及核糖体亚基的出核转运机制了解得较少。真核细胞中RNA一般要经过转录后加工、修饰成为成熟的RNA分子后才能被转运出核。①由RNA聚合酶I转录的rRNA分子，总是在核仁中与从胞质中转运进来的核糖体蛋白结合形成核糖体亚基，以RNP的形式离开细胞核，转运过程需要能量。②由RNA聚合酶Ⅲ转录的5 S TRNA与RNA的转运是一种由蛋白质介导的过程。③由RNA聚合酶Ⅱ转录的核内异质RNA( heterogeneous nuclear RNA， hnRNA)，首先需要在核内进行5′端加帽和3′端附加多腺苷酸序列( poly A)以及剪接等加工过程，然后形成成熟的mRNA出核，出核转运也是一个需要载体的主动运输过程。真核细胞的 SnRNA、mRNA与tRNA，无论在细胞质还是细胞核中，都是与相关的蛋白质结合在一起，即以各种RNP的形式存在的。所谓RNA的出核转运实际上是RNA蛋白质复合体的转运，即RNA的核输出离不开特殊的蛋白质因子的参与，这些蛋白质因子本身含有出核信号。日前人们正致力于寻找在RNA分子与核孔复合体之间起桥梁作用的信号与载体。现已发现一些与RNA共同出核的蛋白因子，如HⅣV病毒的Rev蛋白、转录因子TFⅢA、蛋白激酶A抑制因子PKI等，含有对它们的出核转运起决定作用的氨基酸序列，命名为核输出信号( nuclear export signa，NES)。此外，有迹象表明入核转运与出核转运之间可能有某种联系，如它们可能需要某些共同的因子。
三、核纤层
哺乳动物体细胞的核纤层主要由三种核纤层蛋白构成，它们分别是 amin A、 lamin B和 lamin C。其中， lamin a和 lamin c是同一个基因的不同拼接体( splicing variant)，前566个氨基酸完全相同，但是C端的序列是不一样的。 lamin a/c的表达具有组织与发育时期的特异性，但 lamin B则在哺乳动物的所有细胞中表达在早期小鼠胚胎中， lamin A核纤层蛋白不表达，所以它们被认为可能与细胞的分化有关。 lamin B缺失的小
鼠成纤维细胞的细胞核变形、细胞分化异常、染色体倍数增加以及过早地衰老。
核纤层蛋白本身形成纤维状网络结构(图9-6)。
纤维直径与中间丝类似，约10m。所以，有人也将核纤层蛋白认为是一类特殊的中间丝蛋白。核纤层蛋白与其他蛋白质存在结构与功能上的相互关系。这些蛋白质主要包括一些核被膜内膜蛋白( INM protein)，如SUN1(Sad1-Unc84)、LAP( lamin- associated polypeptide)；核孔复合体蛋白；细胞骨架结合蛋白，如Nesprin；核基质与染色质结合蛋白，如BAF( barrier-to autointegration factor核纤层的功能主要包括以下几个方面：①结构支撑功能。核纤层蛋白形成骨架结构支撑于核被膜的内侧，使得核被膜能起到细胞核与细胞质之间的隔离与信息交换功能。核纤层的骨架功能还得以使细胞核维持正常的形状与大小。②调节基因表达。果蝇细胞中基因组范围的研究结果表明，沉默基因更倾向于分布于核纤层附近，异染色质更易与核纤层结合，而且核纤层附近染色质的乙酰化水平较低。然而，在酵母细胞中活跃转录的基因也分布于核纤层附近，它们常与核孔复合体结合。所以，核纤层与基因表达的确切关系还不是非常清楚。很可能在不同物种的细胞中，甚至不同组织的细胞中情况不一样。③调节DNA修复。研究表明， lamin A核纤层蛋白是双链DNA断裂修复必需的。核纤层蛋白功能异常患者细胞中的基因组变得不定，DNA修复反应滞后，端粒变短。④与细胞周期的关系。细胞分裂过程中，核纤层蛋白解聚成可溶的单体或与崩解后的核被膜相结合。新核形成时，核被膜与染色质结合的同时，核纤层也最后重新形成。
核纤层蛋白基因的突变导致的核纤层功能丧失会引起多种疾病。已知的与 amin a相关的疾病有11种之多。如 Hutchinson- Gilford早老综合征是由于 lamin A的C端的50个氨基酸的缺失，非典型性 Wermer综合征是由于A57P、R133L和L140R的氨基酸改变等。 lamin B受体功能改变则会引起 Pelger-Huet综合征。
