第一节 核糖体的类型与结构

一、核糖体的基本类型与化学组成

核糖体有两种基本类型：一种是原核细胞核糖

体，另一种是真核细胞核糖体。两种核糖体都由两个大小不同的亚基( (subunit)组成，每个亚基都含有大量的rRNA和蛋白质。原核细胞核糖体沉降系数为70(S为 Svedberg沉降系数单位)，分子质量约为2500kda；真核细胞核糖体沉降系数为80S，分子质量约为4200kDa。体外实验表明，70S核糖体在Mg2浓度小于1mmol/L的溶液中，易解离为50S与30S的大小亚基(图10-1)。当溶液中Mg浓度大于10mmol/L时，两个核糖体常常形成100S的二聚体。真核细胞线粒体与叶绿体内有自身的核糖体，叶绿体中核糖体沉降系数近似于70S，而线粒体中核糖体的沉降系数在不同物种间有所差异，酿酒酵母线粒体核糖体沉降系数近似于70S，而哺乳动物线粒体中核糖体沉降系数为55S。

用EDTA、尿素和一价盐可逐级去掉核糖体上的核糖体蛋白，最后得到纯的rRNA。对核糖体的成分分析结果如表10-1所示。在原核细胞大肠杆菌中50S与30S的大小亚基的分子质量分别为1600kDa和900kDa。小亚基中含有一个16S的rRNA分子，分子质量为600kDa，由1542个核苷酸组成。大亚基含有一个23S的rRNA分子，分子质量为1200kDa，由2904个核苷酸组成。大亚基还含有一个5S的rRNA，分子质量为30kDa，仅由120个核苷酸组成。从30S小亚基中已发现有21种不同的蛋白质分子(称为S蛋白)，50S的大亚基约含34种蛋白质(称为L蛋白)在大肠杆菌核糖体中除了L7/L12有4个拷贝，其余的核糖体蛋白仅有一个拷贝。

80S核糖体普遍存在于真核细胞内，对分离的核糖体进行理化性质测定，发现与原核细胞核糖体具有类似的特征。随着溶液中Mg2浓度的降低，80S核糖体可解离为60S与40S的大小亚基；当Mg2浓度增高时，80S核糖体又可形成120S的二聚体。对80S核糖体的成分分析结果如表10-1所示，60S与40S亚基的分子质量分别为2800kDa与1400kDa。小亚基中含有一个18S的rRNA分子，分子质量为900kDa。大亚基中含有一个28S的rRNA分子，分子质量为1600kDa，还含有一个5S的rRNA分子和一个5.8S的rRNA分子。

在不同的真核细胞中，核糖体也存在着差异，如动物细胞核糖体的大亚基内有28 S TRNA，而植物细胞、真菌细胞与原生动物细胞核糖体的大亚基中却不是28SrRNA，而是25S~26 S TRNA；在低等真核生物细胞中构成核糖体的rRNA类型比较复杂，可能不仅限于以上几种。真核细胞核糖体的小亚基约含33种蛋白质，大亚基约含49种蛋白质(表10-1)。

rRNA中的某些核苷酸残基在修饰酶的作用下会发生化学修饰。这些修饰主要包括核糖2-OH甲基化(2-0-Me)、假尿嘧啶化。此外，核苷酸碱基上不同位置的氨基也可能发生不同的化学修饰，如：N，N-双甲基腺苷酸(m2A)、N-甲基腺苷酸(mA)、N乙酰胞嘧啶(acC)等。这些化学修饰的核苷酸残基通常位于核糖体保守的功能区域。如E.coli16 S TRNA上有10个核苷酸残基含有甲基化修饰，1个核苷酸残基含有假尿嘧啶化修饰，3端高度保守序列中2个相邻的腺嘌呤核苷酸中的4个甲基化位点m2A1518、m2A1519，可能参与30S和50S亚基的结合过程。E.coli23 S TRNA上包含了25个有化学修饰的核苷酸残基。在酿酒酵母中，约有55个核苷酸残基发生2-0-Me修饰，约有45个核苷酸残基发生假尿嘧啶化修饰。真核细胞rRNA修饰的种类和数量均比原核细胞rRNA高核糖体大小亚基也可以游离于细胞质基质中，通常当小亚基与mRNA结合后大亚基才与小亚基结合形成完整的核糖体。肽链合成终止后，大小亚基解离，又游离于细胞质基质中。

二、核糖体的结构

作为蛋白质的合成机器，核糖体是细胞中最为复杂的结构之一，它很像一个流动的小工厂，在其他辅助因子的帮助下，以极快的速度合成肽链(真核细胞每个核糖体每秒能将2个氨基酸添加到肽链上，而细菌核糖体合成速度可达20个氨基酸/秒)。对核糖体结构进行精细分析的一项重要手段是X射线衍射分析，其前提是获得高质量的核糖体晶体。由于核糖体分子量太大，结构太复杂，直到20世纪70年代，许多结晶学家对于核糖体能否结晶仍然表示怀疑。1980年，以色列科学家A.E Yonath等得到了核糖体的第一个晶体。随后20年，通过不断改进，科学家们最终获得了死海微生物嗜盐古菌( Haloarcula marismortui)核糖体50S大亚基2.4A分辨率三维结构以及嗜热栖热菌( (Thermus thermophilus)3.3A和3A分辨率的30S小亚基三维结构。2005年又成功获得E.coli3.5分辨率的70S完整核糖体结构(图10-2)。美国科学家V. Ramakrishnan、t.a. Steitz以及以色列科学家 Yonath I因为对核糖体三维结构研究做出了突出贡献而获得2009年诺贝尔化学奖。在核糖体结构研究中，电子显微镜也发挥了关键作用。20世纪50年代， Palade发现了核糖体，20年后，电镜下观察到了大肠杆菌完整核糖体及其大小亚基的形态。20世纪90年代中期，因为低温电子显微镜技术(cryo-EM)的应用，科学家们获得了核糖体与延伸因子(EF-Tu)以及RNA等分子相互作用的一系列动态结构。结合X射线晶体衍射和低温电子显微镜两种技术获得的数据，人们对核糖体结构和功能的认识更加深入。这些研究结果揭示了核糖体蛋白质与rRNA的三维关系以及核糖体与翻译因子、mRNA、tRNA相互作用的详细信息，对核糖体生物学活性部位有了更加准确的认识，也为基于核糖体结构的抗生素药物设计提供了基础。

从图10-2可见，rRNA折叠成高度压缩的三维结构，不但构成了核糖体的核心，还决定了核糖体的整体形态。这些rRNA像三维拼图玩具的部件一样在核糖体中相互连锁，从而构成一个统一整体。与rRNA的核心地位不同的是，核糖体蛋白通常定位在核糖体的表面，或填充于rRNA之间的缝隙。核糖体蛋白质大多有一个球形结构域和伸展的尾部。最出人意料的是，核糖体蛋白的球形结构域分布于核糖体表面，而其伸展的多肽链尾部则伸入核糖体内折叠的rRNA分子中。分析表明这些肽链由约26%的精氨酸、赖氨酸以及丰富的甘氨酸和脯氨酸组成。但核糖体上的活性部位—催化蛋白肽键形成的地方 包括rRNA。

对核糖体高分辨率的X射线衍射图谱分析表明

(1)每个核糖体含有4个RNA分子的结合位点，其中1个位点供mRNA结合，3个位点供tRNA分子结分别为A位点( amInoac  site)、P位点( peptidyl ite)和E位点( exit sIte)。这些位点横跨核糖体大小亚基结合面。

(2)在核糖体大小亚基结合面，特别是mRNA和tRNA结合处，无蛋白质分布。这也意味着在核糖体起源之初可能仅由RNA组成。

(3)催化肽键形成的活性位点由RNA组成。

(4)大多数核糖体蛋白有一个球形结构域和伸展的尾部，球形结构域分布于核糖体表面，而其伸展的多肽链尾部则伸入核糖体内折叠的rRNA分子中。也有些核糖体蛋白完全没有球形结构域，如小亚基的S14及大亚基的L39e蛋白。许多核糖体蛋白与RNA具有多个结合位点，发挥稳定rRNA三级结构的作用。

对于rRNA，特别是16 S TRNA结构的研究已积累了丰富的资料。大肠杆菌16 S TRNA有1542个碱基通过对500多种不同生物的rRNA序列的分析，发现其一级结构在演化上非常保守，某些区域的序列完全致。16 S TRNA的二级结构具有更高的保守性，尽管不同种的rRNA的一级结构可能有所不同，但它们都折叠成相似的二级结构即由多个茎环(stem-loop)所组成的结构。其中不到半数的碱基配对，且配对区一般小于8bp，而未配对的碱基形成环(loop)。整个16Srna可分成4个结构域，即中心结构域( central domain)、5端结构域(5 domain)、3端主结构域(3 major domain)及3端次结构域(3 minor domain)23 SIRNA结构比16 S TRNA复杂，其二级结构有6个结构域，分别为结构域IⅥ。

rRNA三级结构的稳定涉及多种作用力，如rRNA螺旋间的相互作用以及腺嘌呤插入螺旋小沟的作用力等。在形成三级结构后，16 S TRNA每一个大的结构域都对应小亚基的一个形态部位。如5端结构域形成了小亚基的主体(body)，中心结构域形成了平台 platform)，3端主结构域形成了头部(head)，3端次结构域横跨了界面。而23 S TRNA的6个结构域在50S大亚基中却是相互交织在一起，形成一个“集成”结构这种差异可能体现了韧性是小亚基发挥功能所需要的核糖体蛋白质与rRNA的功能

核糖体上具有一系列与蛋白质合成有关的结合位点与催化位点(图10-3)：

(1)与mRNA结合的位点蛋白质的起始合成首先需要mRNA与小亚基结合。原核生物中，核糖体与mRNA的结合位点位于16 S TRNA的3端，其准确识别的基础是细菌mRNA有一段特殊的 Shine- Dalgarno序列(SD序列)，位于起始密码子上游5~10个核苷酸处。

SD序列能与核糖体小亚基16 S TRNA的3端序列互补结合。真核生物核糖体没有SD序列，其小亚基准确识别mRNA主要依赖于能够特异识别mRNA5端的甲基化帽子的翻译起始因子。

(2)A位点与新进入的氨酰tRNA结合的位点氨酰基位点

(3)P位点与延伸中的肽酰tRNA结合的位点肽酰基位点

(4)E位点tRNA离开核糖体前的结合位点。

(5)与肽酰tNA从A位点转移到P位点有关的转移酶(即延伸因子EF-G)的结合位点。

(6)肽酰转移酶的催化位点

此外还有与蛋白质合成有关的其他起始因子、延伸因子和终止因子的结合位点。这些结合位点位于核糖体的哪个亚基及其确切位点，已有比较多的了解

已知与tRNA结合的P位点、A位点或E位点各自

都涉及一套rRNA上不同的区域。16SRNA与tNA同P位点和A位点的结合有关，23 S TRNA与tRNA同P位点、A位点和E位点的结合有关。例如，与tRNA结合的A位点，在16 S rRNA中主要位于530和14001500区域两部分(数字指rRNA的核苷酸序号)，这也是16SrRNA两个最保守的区域，与tRNA结合最强的区域是G530、A1492和A1493(英文字母代表碱基种类)，其次是A1408和G1494。在16 SIRNA和23 SIRNA中与A位点、P位点或E位点有关的碱基序列几乎都是共同的保守序列，而且与各结合位点有关的一套碱基又各自不同。某些核糖体蛋白，如小亚基上的S2、S3和S14参与氨酰tRNA与A位点的结合，L13和L27则是大亚基上P位点的组成成分。延伸因子EF-G和EF-Tu结合到大亚基的一套相同位点上，位于23 S TRNA2660区域的共同保守序列，特别是与G2655、A2660和G2661结合更为紧密，这些区域也涉及核糖体蛋白L11和L7/L12，它们位于大亚基突起的底部，均与EF-G的功能有关。在研究这些结合位点时，人们也注意到处于不同的结合条件下，核糖体的构象发生了相应的变化，而这些变化对核糖体行使其功能可能是十分必要的。

核糖体中最主要的活性部位是肽酰转移酶的催化位

点。早些时侯人们普遍认为既然酶的本质是蛋白质，那么核糖体中一定有某种蛋白质与蛋白质合成中的催化作用有关。虽然RNA占核糖体的60%以上，但长期以来它仅仅被看做是核糖体蛋白的组织者，即形成核糖体的内部结构框架或是与蛋白质合成过程中所涉及的RNA碱基配对有关。在对核糖体蛋白和rRNA进行大量研究特别是利用化学方法和遗传突变株来研究核糖体蛋白的功能以后，人们对核糖体蛋白是否具有催化蛋白质合成的活性提出了疑问：

(1)很难确定哪一种蛋白质具有催化功能，在大肠杆菌中很多核糖体蛋白突变甚至缺失对蛋白质合成并没有表现出“全”或“无”的影响，即并不引起蛋白质合成的完全抑制。

(2)多数抗蛋白质合成抑制剂的突变株，并非由

于核糖体蛋白的基因突变而往往是rRNA基因发生了突变。

(3)在整个演化过程中，rRNA的结构比核糖体蛋白的结构具有更高的保守性。越来越多的事实使人们推测，rRNA在蛋白质合成过程中可能具有重要作用。

H.f. Noller)用高浓度的蛋白酶K、强离子型去垢剂

SDS以及苯酚等试剂处理大肠杆菌50S的大亚基，去掉与23 S IRNA结合的各种核糖体蛋白。结果发现，得到的23 S IRNA仍具有肽酰转移酶的活性。用对肽酰转移酶敏感的抗生素处理或用核酸酶处理均可抑制其合成多肽的活性，但用阻断蛋白质合成其他步骤的抗生素处理，则肽酰转移酶活性不受影响。这些结果初步揭示了在50S核糖体大亚基中，23SRNA参与催化肽酰转移酶的功能。当然抽提后的23 S TRNA中，还残存不到5%的核糖体蛋白，这些蛋白质很可能是维持rRNA构象所必需的。1985年，T.Cech发现RNA具有催化RNA拼接过程的活性；1992年又证明，RNA具有催化蛋白质合成的活性，这些重要发现不仅有力推动了对核糖体结构与功能的研究，而且对生命的起源与演化过程的探索也提供了重要的依据。2000年，耶鲁大学研究小组在核糖体晶体图谱中定位了肽酰转移酶位点( (peptidyl  transferase site)，发现在该位点的成分全是rRNA，这些成分属于23 S IRNA结构域V的中央环。因此，人们相信rRNA才具有催化功能，核糖体实际上是核酶 (ribozyme)

目前认为，在核糖体中，rRNA是起主要作用的结构成分，其主要功能是：

(1)具有肽酰转移酶的活性

(2)为tRNA提供结合位点(A位点、P位点和E位点)。

(3)为多种蛋白质合成因子提供结合位点。

(4)在蛋白质合成起始时参与同mRNA选择性结合以及在肽链的延伸中与mRNA结合。此外，核糖体大小亚基的结合、校正阅读( proofreading)、模板链或读码框移位的校正，以及抗生素的作用等都与rRNA有关。