第二节 多核糖体与蛋白质的合成

一、多核糖体

核糖体是蛋白质合成的机器。核糖体在细胞内不仅能够单个独立地执行功能，而且通常还由多个核糖体串联在一条mRNA分子上高效地进行肽链的合成。这种具有特殊功能与形态结构的核糖体与mRNA的聚合体称为多核糖体( polyribosome或 polysome)(图10-4)。每种多核糖体所包含的核糖体数量是由mRNA的长度决定的，也就是说，mRNA越长，合成的多肽分子量越大，核糖体的数目也越多。J. Waner和A.rich等发现网织红细胞内合成血红蛋白分子的多核糖体常常含有5个核糖体。根据血红蛋白的一条多肽链的大小(约150个氨基酸)可推算出其mRNA分子的长度约为150m。他们将密度梯度离心技术与电镜负染色技术相结合，观察到网织红细胞内，多核糖体是由一条直径1~1.5mm的mRNA串联5个(有时6个或4个)核糖体组成，相邻核糖体的中心间距为30~35mm，多核糖体的总长约150mm，这与前面的推论相符。细菌的β-半乳糖苷酶由1100个氨基酸残基组成，它的多核糖体中含有约50个核糖体，如将β半乳糖苷酶的基因截短，mRNA的长度随之缩短，多核糖体的大小及核糖体的数目也成比例地减少。

在真核细胞中每个核糖体每秒能将两个氨基酸残基加到多肽链上，而在细菌细胞中可将20个氨基酸加到多肽链上，因此合成一条完整的多肽链平均需要20秒至几分钟。即使在这样短的时间里，当第一个核糖体结合到mRNA上起始蛋白质合成后，不久第二个核糖体便结合到mRNA上，相邻的核糖体间距约80个核苷酸的距离。由于蛋白质的合成是以多核糖体的形式进行这样细胞内各种多肽的合成，无论其分子量的大小或是mRNA的长短如何，单位时间内所合成的多肽分子数目都大体相等，即在相同数量的mRNA的情况下，可大大提高多肽合成速度，特别是对于分子量较大的多肽。多肽合成速度提高的倍数与结合在mRNA上的核糖体数目成正比。在细胞周期的不同阶段，细胞中数以万种的mRNA有些在合成，有些在降解，其种类与浓度不断发生变化，以多核糖体的形式进行多肽合成，这对mRNA的利用及对其数量的调控更为经济和有效。

原核细胞中，在mRNA合成的同时，核糖体就结合到mRNA上，即DNA转录成mRNA和mRNA翻译成蛋白质这两个生命活动是同时并几乎在同一部位进行的，所分离的多核糖体常常与DNA结合在一起。真核细胞中，多核糖体或附着在内质网上，或游离在细胞质基质中。

二、蛋白质的合成

蛋白质合成，或称蛋白质翻译是细胞中最复杂、最精确的生命活动之一。蛋白质的合成需要各种携带氨基酸的tRNA、核糖体、mRNA、多种蛋白质因子及能量分子GTP等的参与。在蛋白质合成过程中，有三个关键问题，即如何催化肽键的形成?如何识别正确的tRNA?tRNA和mRNA如何通过核糖体的活性位点?目前这些问题都有了答案。

蛋白质合成主要包括三个主要阶段：肽链的起始( InItiation)、肽链的延伸( (elongation)和肽链的终止( termination)(图10-5)。原核细胞蛋白质合成最为清楚，下面以原核细胞为例，简单介绍蛋白质翻译的过程。

(一)肽链的起始

蛋白质合成起始涉及mRNA、起始tRNA和核糖体小亚基间相互作用和装配。

1.30S小亚基与mRNA的结合

蛋白质合成起始阶段，mRNA只能够与细胞质基质中游离的核糖体30S小亚基结合，此时，mRNA的起始密码子( initiation codon)AUG必须精确地定位在30S小亚基的P位点上。由于mRNA内部仍然可能有密码子AUG，那么30S小亚基是如何准确识别起始密码子AUG的呢?研究发现，在细菌mRNA起始密

码子AUG上游5~10个碱基处有一段特殊的序列，即SD序列。SD序列能与核糖体小亚基16 S TRNA3端的碱基序列互补结合，从而保证30S小亚基能准确识别起始密码子AUG，并结合到mRNA上。SD序列为：5- AGGAGG-3，16 S IRNA3端与此互补的序列为3′- UCCUCC-5′

30S小亚基与mRNA的结合需要起始因子

( initiation factor，F)的帮助。这些起始因子仅位于30S亚基上，而且一旦30S亚基与50S亚基结合形成70S核糖体后便释放。显然，起始因子的主要作用是帮助形成起始复合物。原核细胞有三种起始因子，即F1、F2和IF3。其中，30S-IF1复合体晶体结构显示，IF1与30S亚基A位点结合，协助30S亚基与mRNA的结合并防止氨酰tRNA错误进入核糖体的A位点；IF2是一种GTP结合蛋白，协助第一个氨酰tRNA进入核糖体；IF3能防止核糖体50S大亚基提前与小亚基结合，并有助于第一个氨酰RNA进入核糖体，在调节核糖体动态平衡以及30S亚基与mRNA结合能力方面发挥了重要作用(图10-6)。结合生化与结构数据，发现在蛋白质翻译起始阶段，30S亚基所有的tNA结合位点都被占据，如A位点被IF1占据，P位点被起始tRNA占据，而E位点被IF3占据。其生物学意义可能与蛋白质合成的正确起始有关。

真核细胞蛋白质翻译的起始与原核细胞类似，但有一定的差异。如真核细胞40S小亚基需要十多种起始因子帮助形成起始复合物。起始复合物识别mRNA结合位点的机制不同，小亚基在起始因子的帮助下首先识别mRNA5端甲基化帽子，然后沿着mRNA移动扫描 scanning)。通常情况下，起始复合物将扫描到的第个AUG作为起始密码子。

2.第一个氨酰tRNA进入核糖体

当mRNA与小亚基结合后，在IF2的帮助下，携带有甲酰甲硫氨酸的起始trna(Met-tra)进入核糖体P位点，通过反密码子与mRNA中的AUG识别，之后释放IF3。

原核生物中的第一个氨酰tRNA是甲酰化的甲硫氨酰tRNA，而真核生物中第一个氨酰tRNA的甲硫氨酸不会被甲酰化

3.完整起始复合物的装配

旦起始tRNA与AUG密码子结合，核糖体大亚基便与起始复合物结合，形成完整的70S核糖体mRNA起始复合物。该过程伴随与IF2结合的GTP水解，IF1、IF2和IF3释放。

(二)肽链的延伸

旦起始复合物形成，蛋白质合成随即开始，这过程称为肽链的延伸。主要包括4个步骤：氨酰tRNA在核糖体A位点的入位、肽键的形成、转位( translocation)和tRNA的释放(图10-7)。

1.氨酰tNA在核糖体A位点的入位起始的 tRNA占据P位点，核糖体接受第二个氨

酰tRNA进入A位点，这就是肽链延伸的第一步。为了有效地结合A位点，第二个氨酰tNA必须与有GTP的延伸因子( elongation factor，eF)EF-tu结合形成三元复合体(氨酰tNA-EF-T-GTP)。尽管任何形成复合体的氨酰RNA都能够进入A位点，但只有其反密码子能与A位点的mRNA密码子匹配的氨酰tNA才能被核糖体牢牢捕捉并定位在A位点，从而保证正确识别tRNA。氨酰tRNA到位后，结合在EFTu上的GTP水解，EF-Tu连同结合在一起的GDP离开核糖体，被另一个因子EF-Ts介导重新生成EF-T-GTP

在真核细胞中，延伸因子eEF1A的功能与原核细胞中EFTu功能类似。

2.肽键的形成

当核糖体的P位点与A位点都有tRNA时，通过肽键的生成将两个氨基酸结合起来。具体来讲，是A位点氨酰tRNA上氨基酸的氨基与P位点tRNA上氨基酸的羧基形成肽键。这一反应由肽酰转移酶催化，该酶是核糖体大亚基rRNA，活性位点位于23 S TRNA结构域V的中央环。

3.转位

形成第一个肽键时，A位点的tRNA分子一端仍然与mRNA的密码子结合，另一端与一个二肽结合。此时，P位点的tRNA分子已经如释重负，没有携带任何氨基酸。接下来便是延伸反应的第三步：转位，即核糖体沿着mRNA分子的5→3方向移动3个核苷酸(一

个密码子)。在转位过程中，携带二肽的RNA从A位点移位到P位点，而没有携带任何氨基酸的RNA从P位点移位到E位点。原核细胞GTP结合的延伸因子EF-G能促进移位过程的发生。在真核细胞中，结合GTP的延伸因子eEF2促进转位过程的发生。

4.tA的释放

延伸反应的最后一步是tRNA离开核糖体E位点。

旦肽酰tRNA通过转位从A位点移位到P位点后，A位点再次接受下一个能与mRNA第三个密码子匹配的氨酰tRNA，又开始新的肽链延伸循环。

(三)肽链的终止

如果A位点处mRNA上的三核苷酸是UAA、UGA或UAG，即终止密码子( termination codon或stop codon)，由于没有与之对应的tRNA，于是蛋白质合成终止。释放因子( release factor，rf)rf可识别UAA或UAG，RF2识别UAA或UGA，催化蛋白质合成的

终止。RF1或RF2识别A位点的终止密码子并促使肽酰转移酶催化水分子添加到肽酰tRNA上。这一过程实际上与肽键形成类似，只不过是水分子代替了氨基成为活化肽酰基的受体。这一反应使得多肽链末端的羧基游离出来，肽链延伸终止形成完整的蛋白链。蛋白链随即脱离核糖体进入细胞质基质，而核糖体也在核糖体回收因子( ( ribosome recycling factor)的帮助下从mRNA上释放下来，同时解离成30S和50S亚基。

在真核细胞中，释放因子eRF1可以识别所有的终止密码子。释放因子eRF1正确识别终止密码子需要GTP酶eRF3的帮助，而eRF1介导肽酰tRNA的水解需要ATP酶Rli1的帮助

在某些情况下，由于mRNA在转录或拼接过程中发生了错误，而缺少终止密码子，它们在蛋白质翻译过程中会导致核糖体无法从mRNA上释放下来。这不仅影响多肽链的合成，还会影响核糖体的再利用。然而，人们发现细胞中存在解决这一问题的“挽救”机制，如在细菌中的ArfA-RF2挽救系统，它能使缺少终止密码子的mRNA的肽链合成正常终止，将核糖体从mRNA上释放下来以循环使用。最近，人们应用低温电镜单颗粒技术阐释了这一复杂过程的分子机理。

研究发现，新生肽链通过核糖体大亚基的一个特定通道进入细胞质基质，该通道称为肽通道。肽通道长约10m，宽1~2m，是一个亲水性通道，内壁主要由23 S IRNA组成，仿佛不粘锅表面的聚四氟乙烯( teflon)一样，由于没有与肽链互补的结构存在，因此，新生肽链能顺利地通过肽通道。肽通道大小也提示，新生肽链通过肽通道时，往往不会以高级结构形式通过。从核糖体肽通道出来时，一些新生肽链将在共翻译分子伴侣的帮助下，形成正确的三维构象。另外一些肽链在翻译完成后，先从核糖体上释放出来，在细胞质分子伴侣的帮助下形成正确的三维构象。

核糖体结构的解析使我们对蛋白质合成的认识发生了很大变化。随着对结合了延伸因子与释放因子的70S核糖体结构的解析，特别是在整个翻译周期中核糖体结构状态的解析，汇合结构、生化及功能研究数据，一部核糖体如何合成蛋白质的分子“电影”逐渐清晰地呈现在我们面前。

三、核糖体与RNA世界

（一）核糖体的本质是核酶

核酶是指一类具有催化活性的RNA分子。1981年，Cech和他的同事在研究四膜虫的26S前体rRNA( precursor rRNA)加工去除内含子时惊奇地发现，内含子的切除是由26S前体rRNA自身催化的，而不是蛋白质，这一现象称为RNA自剪接(self- splicing)。这说明RNA分子具有催化活性，因此被命名为核酶。Cech因为首次发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。从前面的介绍可以看到，核糖体是一种分子量大、结构复杂的细胞器，RNA组分占了核糖体整体质量50%以上。早先证据表明，在蛋白质合成过程中催化肽键形成的肽酰转移酶是23 S TRNA，随后在核糖体的结构研究中获得直接证据。2000年，核糖体大小亚基的高分辨三维结构研究证实，rRNA负责维持核糖体的整体结构、tRNA在mRNA上的定位等功能；最有意义的发现是肽键形成位点，即肽酰转移酶中心仅由23 S TRNA组成。显然，肽键形成的催化反应是由rRNA执行的。另外，核糖体的三个结合位点，即A位点、P位点和E位点也主要是由rRNA组成。因此，核糖体的本质是

核酶。

(二)RNA世界与生命起源

遗传信息的表达需要一套复杂的机器，这套机器将DNA中储存的遗传信息表达为生命活动的主要执行者蛋白质。显然，在遗传信息表达过程中，蛋白质的合成依赖于DNA和RNA，而DNA和RNA的合成又离不开蛋白质。这就提出了一个有关生命起源最有趣的问题：在生命起源之初，究竟先有核酸，还是先有蛋白质。20世纪80年代，w. Gilbert等人大胆提出，最早出现的生物大分子很可能是RNA，它兼具了DNA与蛋白质的功能，不但可以像DNA一样储存遗传信息，而且还像蛋白质一样进行催化反应，DNA和蛋白质则是演化的产物。这就是著名的“NA世界”( RNA world)假说。根据这一假说，原始的具有自我复制和催化能力的RNA在以后的亿万年演化过程中，逐渐将其携带遗传信息的功能让位于性质上更加稳定的DNA分子，将其催化功能让位给了催化能力更强的蛋白质核糖体23 S TRNA具有肽酰转移酶的活性，在蛋白质合成中催化肽键形成。核糖体是核酶这一发现，对RNA世界假说起到了很大的支撑作用。除了RNA可催化RA和DNA水解、连接、mRNA的拼接( (splicing)等现存“活化石”证据外，在体外已证明人工合成的RNA还可催化RNA聚合反应以及RNA、DNA的磷酸化，RNA氨酰基化、烷基化，能催化糖苷键形成、氧化还原反应等多种反应。

那么，RNA是如何实现向DNA的转变的呢?通过体外加速演化手段，研究人员成功地在试管中将具有核酶活性的RNA转变成了DNA。这些发现有助于理解生命起源过程中RNA是如何实现向DNA转变的。遗传信息的储存让位于DNA，从演化来讲，更为有利，因为双链DNA比单链RNA稳定，且DNA链中胸腺嘧啶代替了RNA链中的尿嘧啶，使之易于修复，作为遗传物质载体可储存大量的信息并能更稳定地遗传

此外，蛋白质的合成又是如何演化的呢?在今天的细胞中，蛋白质的合成是在一个结构非常复杂、由蛋白质和RNA组成的核糖体中完成的，显然，在演化中蛋白质合成必须是在有了一个原始的蛋白质合成机器后才可能发生。在今天的细胞中，有些短肽的合成就是通过肽合成酶的催化完成的，它不需要复杂的蛋白质翻译机器核糖体，也不需要mRNA的指令。这不禁让人推测，在RNA世界中，原始蛋白质的合成不需要mRNA，很可能就是直接通过RNA分子催化完成的。这种由RNA分子催化肽键形成的功能在今天的细胞中仍然被遗留下来了，只不过起催化作用的RNA与蛋白质一道形成核糖体，而且，实验室中的核酶也能执行氨酰化反应。因此，很可能在RNA世界，类似NA一样的接头分子能和特异的氨基酸结合。随后，一种特异性不高的肽酰转移酶随着时间的推移，逐渐获得了将氨酰tRNA精确定位到模板RNA分子上的功能，最终出现了今天的核糖体，蛋白质合成得以演化。而蛋白质因为自身的多样性，最终接管了RNA分子的绝大多数催化与结构功能，成为结构和功能复杂的细胞演化的基础。

如果生命起源于RNA的假说是对的，我们就不难勾画出生命起源的大致轮廓。生命的最早形式可能是由膜包裹的一套具有自我复制能力的分子体系和简单的物质与能量供应体系组成，其遗传物质的载体是RNA(原始RNA)而不是DNA。构成核酸的基本成分是核糖，而脱氧核糖是由核糖还原而成的事实也说明了这点。在最早的细胞中，可能还存在一个前RNA世界(re- RNA world)，集遗传、结构与催化功能于一身，尔后RNA分子逐渐接管了这些功能。RNA的催化效率远远低于蛋白质，在漫长的演化过程中，由RNA催化产生了蛋白质，进而DNA代替了RNA的遗传信息功能，蛋白质则取代了绝大部分RNA作为酶的功能，逐渐演化成今天遗传信息流的模式—中心法则(图10-8)。

有趣的是，生命演化到现在，仍然存在一个RNA世界。至今在遗传信息表达过程中，不仅还要通过RNA完成遗传信息的传递和密码的翻译，而且一些重要的反应过程如mRNA的拼接和蛋白质的合成仍需要RNA的催化作用。同时，RNA(包括 micrORNA)还可通过RNA干扰等方式决定mRNA的命运、对DNA进行修饰以调控基因的表达甚至使整条染色体失活(如哺乳动物X染色体失活)等。因此，无论在生命起源之初，还是在今天的细胞中，RNA对生命演化的影响、对基因表达的调控都发挥着很重要的作用，也许我们对其认识才刚刚开始。