第一节 细胞增殖调控
人们开展细胞周期调控研究已有几十年历史。在20世纪五六十年代，S期的发现和细胞周期中4个时相的划分，使细胞周期调控研究辉煌多时。最近30多年，细胞周期调控研究再现辉煌，并取得了突飞猛进的发展，获得了许多突破性成果。
一、MPF的发现及其作用
MPF，即卵细胞成熟促进因子( maturation-promoting factor)，或细胞有丝分裂促进因子( mItosIs promoting factor)，也称M期促进因子(M- phase promoting factor)。mPF最早发现并被命名于20世纪70年代初期。随后的工作不仅逐步鉴定了MPF的构成，同时也逐步证明了其在细胞周期调控中的重要作用。
1970年，R.T. Johnson和P.n.rao将Hea细胞同步化在细胞周期中的不同时相，然后将M期细胞与其他间期细胞在仙台病毒介导下融合，并继续培养一定时间。他们发现，与M期细胞融合的间期细胞发生了形态各异的染色体凝缩，并称之为早熟染色体凝缩 premature chromosome condensation，PCC)。此种染色体则称为早熟凝缩染色体。不同时期的间期细胞与M期细胞融合，产生的PCC的形态各不相同。G1期PCC为细单线状，S期PCC为粉末状，G2期PCC为双线染色体状(图13-1)。PCC的这种形态变化可能与DNA复制状态有关。早熟染色体凝缩在其他细胞中也被证明。M期细胞可以诱导PCC，提示在M期细胞中可能存在一种诱导染色体凝缩的因子，称为细胞有丝分裂促进因子。
971年， Y. Masul和C.. Markert用非洲爪蟾卵做实验，明确提出了MPF这一概念。非洲爪蟾卵细胞发育过程可以划分为6个阶段，即第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V和Ⅵ期。第至Ⅳ期为卵母细胞生成和生长阶段。第Ⅳ期卵母细胞达到一定体积，停止生长，等待成熟。此时的卵母细胞处于减数第一次分裂期前期阶段，有一个体积较大的细胞核，称为生发泡( germinal vesicle，gv)。卵母细胞成熟需要孕酮的刺激。在孕酮作用下，卵母细胞向V和Ⅵ期转化，生发泡破裂( GV broken down)，染色体凝缩，进行减数分裂I；然后立即进行减数分裂Ⅱ，并停留在分裂中期，即成熟的卵细胞(第Ⅵ期卵细胞)。卵细胞受精后，形成受精卵，很快便开始卵裂(图13-2)。
Masui和 Markert用解剖方法分离第Ⅳ期卵母细胞，并用孕酮进行体外刺激，诱导卵母细胞成熟，然后进行细胞质移植实验。他们发现，将孕酮诱导成熟的卵细胞的细胞质注射到卵母细胞中，可以诱导后者成熟；再将后者的细胞质少量注射到一些新的卵母细胞中，这些新的卵母细胞仍被诱导成熟；再将刚被诱导成熟的卵细胞的细胞质少量注射到另一些新的卵母细胞中，仍然可以诱导卵母细胞成熟(图13-3)。因而他们认为，在成熟的卵细胞的细胞质中，必然有一种物质，可以诱导卵母细胞成熟。他们将这种物质称作成熟促进因子，即MPF。
进一步研究发现，用孕酮诱导卵母细胞成熟，卵母细胞需要进行一定程度的蛋白质合成。在有蛋白质合成抑制剂存在的情况下，孕酮不能诱导卵母细胞成熟。成熟卵细胞的细胞质诱导卵母细胞成熟，则不需要蛋白质合成；在蛋白质合成抑制剂存在的情况下，也可以诱导卵母细胞成熟。这些实验结果提示，在成熟卵细胞中，MPF已经存在，只是处于非活性状态，被称为前体MPF(Pe-MPF)。非活性态的前体MPF通过翻译后修饰，可以转化为活性态的MPF。
MPF被发现以后，不少学者便着手MPF的纯化工作，但一直进展缓慢，直到1988年， Maler实验室的M. J. Lohka等人以非洲爪蟾卵为材料，分离获得了微克级的纯化MPF，并证明其主要含有p32和p45两种蛋白。p32和p45结合后，表现出蛋白激酶活性，可以使多种蛋白质底物磷酸化。因而证明，MPF是一种蛋白激酶。
二、p342激酶的发现及其与MPF的关系在研究MPF工作的同时，另一批生物学家则以酵母为材料，从另一个侧面对细胞周期调控进行着深入研究。以L.. Hartwell为代表的酵母遗传学家在不同温度条件下培养芽殖酵母，分离获得了数十个温度敏感型突变株( (temperature-sensitive mutant，ts)。对芽殖酵母来说，允许温度( permissive temperature)常为20~23℃，限定温度( restrictive temperature)通常为35~37℃。突变株最基本的特点是，在允许温度条件下，可以正常分裂繁殖，而在限定温度条件下，则不能正常分裂繁殖。这种在限定温度下失去正常分裂繁殖能力的现象，是由于某个基因发生突变而引起的。不同的突变株，发生突变的基因不同；在限定温度下，细胞在细胞周期中所停留的时相以及细胞所表现出的形态结构也常常是不同的，因而可以对不同突变株的基因变化和基因表达进行综合分析。以P.m. Nurse为代表的另一批酵母生物学家在不同温度下培养裂殖酵母细胞，也分离出了数十个温度敏感型突变株。和芽殖酵母类似，在限定温度下，不同突变株的某个基因也发生了突变，其细胞停留在细胞周期中的某个特定时相。CDC基因调控酵母细胞分裂和细胞周期，根据CDC基因被发现的先后顺序等，对这些基因进行了命名，如dc2、Cdc25、Cdc28等，尽管当时CDC基因尚未被分离出来。
Cdc2基因是裂殖酵母细胞中最重要的基因之Cdc2基因突变导致细胞停留在G2M期交界处。Cdc2基因也是第一个被分离出来的CDC基因。它的表达产物为一种分子质量为34kDa的蛋白质，被称为p34进一步研究发现，p342具有蛋白激酶活性，可以使多种蛋白底物磷酸化，因而又被称为p342激酶。p342激酶在裂殖酵母细胞周期调控过程中，起着关键性作用。在芽殖酵母中也有一个关键性的CDC基因，称为Cd28。dc28基因突变，芽殖酵母细胞或者停留在G1S期交界处，或者停留在GM期交界处。Cdc28基因是继Cdc2基因之后，第二个被分离出来的CDC基因。Cdc28基因产物也是一种分子质量为34kDa的蛋白质，称为p342p342也是一种蛋白激酶，在G2M期转换过程中起着中心调节作用，因而是p34d2的同源物。同时，p342对G1/S期转换也是必需的。更进一步的研究发现，不管是p342还是p342，其本身并不具有激酶活性，只有当其与有关蛋白质结合后，其激酶活性才能够表现出来。例如，p342必须和另一种蛋白质p5613结合，才具有激酶活性。
知道p342与MPF都具有激酶活性并能够促进G2/M期转换以后，人们不禁要问，p342和MPF有何关系呢?当MPF的基本构成被确认以后， Maller实验室和 Nurse实验室立即开始合作，很快便证明MPF中的p32可以被p342特异抗体所识别，并且p34d2多肽片段可以增强MPF活性，表明二者为同源物。其同源性又被后来的序列分析进一步证明。了解p32与p342以后，人们进一步提出，蛙MPF的p45和酵母的p56c3是否也有一定关系呢?
在开展上述工作的同时，以R.T.Hunt为代表的另一些科学家以海胆卵为材料，对细胞周期调控进行了深入的研究。J. Evans等人于1983年报道，在海胆卵细胞中存在有两种特殊蛋白质。这两种蛋白质的含量随细胞周期进程变化而变化，一般在细胞间期内积累，在细胞分裂期内消失，在下一个细胞周期中又重复这一消长现象，因而他们将这两种蛋白质命名为周期蛋白( (cyclin)。随后，这些周期蛋白很快便被分离和克隆出来，并被证明广泛存在于从酵母到人类等各种真核生物中。进一步研究证明，周期蛋白为诱导细胞进入M期所必需。而且，各种生物之间的周期蛋白在功能上有着广泛的互补性。将海胆 cyclin B的mRNA引入到非洲爪蟾卵非细胞体系中，其翻译产物可以诱导该非细胞体系进行多次细胞周期循环。将一种基因工程表达的抗降解的 cyclin△90引入非洲爪蟾卵非细胞体系或直接显微注射到非洲爪蟾卵细胞中，可以稳定MPF活性。所有这些实验结果均提示周期蛋白可能参与MPF的功能调节。当MPF被提纯以后， Maler实验室和Hunt实验室立即开始合作，并很快证明MPF的另一种主要成分为 cyclin B。序列分析证明， cyclin B与酵母的p5613为同源物。至此，MPF的生化成分便被确定下来，它含有两个亚基，即Cdc2为其催化亚基，周期蛋白为其调节亚基。当两者结合后，表现出蛋白激酶活性。
三、周期蛋白
自1983年首次发现周期蛋白后，许多科学家纷纷开展周期蛋白研究。在短短的十年间，人们便从各种生物体中克隆分离了数十种周期蛋白，如酵母的Cln1Cn2、Cln3、Cb1—Clb6，高等动物的周期蛋白A1、A2、B1、B2、B3、C、D1、D2、D3、E1、E2、F、G、H、L1、L2、T1、T2等。目前在人体中已经发现25种周期蛋白。这些周期蛋白在细胞周期内表达的时相有所不同，所执行的功能也多种多样。这些周期蛋白有的只在G1期表达并只在G1期和S期转化过程中执行调节功能，所以常被称为G1期周期蛋白，如 cyclin C、D、ECn1、Cln2、Cln3等；有的虽然在间期表达和积累，但到M期时才表现出调节功能，所以常被称为M期周期蛋白，如 I cyclin A、B等。G1期周期蛋白在细胞周期中存在的时间相对较短。M期周期蛋白在细胞周期中则相对稳定。
各种周期蛋白之间有着共同的分子结构特点，但也各有特性。首先，它们均含有一段相当保守的氨基酸序列，称为周期蛋白框( cyclin box)(图13-4)。周期蛋白框含约100个氨基酸残基，其功能是介导周期蛋白与CDK结合。不同的周期蛋白框识别不同的CDK，组成不同的 cyclin-CDK复合体，表现出不同的CDK活性。M期周期蛋白的分子结构还有另一个特点，在这些蛋白质分子的近N端含有一段由9个氨基酸残基组成的特殊序列( RXXLGXIXN，其中X代表任意氨基酸)，称为破坏框( destruction box)。在破坏框之后，为一段约40个氨基酸残基组成的赖氨酸富集区。破坏框主要参与泛素依赖性的 cyclin A和B的降解。G1期周期蛋白分子中不含破坏框，但其C端含有一段特殊的PEST序列。研究认为，PEST序列与G1期周期蛋白的更新有关。
不同的周期蛋白在细胞周期中表达的时期不同，并与不同的CDK结合，调节不同的CDK活性。图13-5显示了几种周期蛋白在哺乳动物细胞和酵母细胞中的表达和积累状况。在哺乳动物细胞中， cyclin A在G1期的早期即开始表达并逐渐积累，到达G1/S期交界处，其含量达到最大值并一直维持到G2M期； cyclin B则从G1期晚期开始表达并逐渐积累，到G2期后期阶段达到最大值并一直维持到M期的中期阶段，然后迅速降解；作为G1期周期蛋白的 cyclin D在细胞周期中持续表达；而 cyclin E则在M期的晚期和G1期早期开始表达并逐渐积累，到达G1期的晚期，其含量达到最大值，然后逐渐下降，到达G2期的晚期，其含量降到最低值。在裂殖酵母和芽殖酵母中，周期蛋白含量的消长情况与哺乳动物细胞中的有许多相似之处。作为M期周期蛋白芽殖酵母中的Clb1、Clb2和裂殖酵母中的Cdc13、Cigl均在G1期的后期开始表达，到G2期达到最大值，到达M期中期后则迅速消失。作为G1期周期蛋白，芽殖酵母中的Cln1、Cln2和裂殖酵母中的Cig2则在M期的后期开始表达，到达G1期后期的“起始点”前，其含量达到最大值，然后逐渐降低，到达G2期时降到最低值。另外，在裂殖酵母中还发现其他两种B类周期蛋白Clb3、Clb4。二者的表达早于Clb1和Clb2。但对其功能尚了解不多。有人推测它们可能在G1/S期转化和S期中起调节作用。
对于其他种类的周期蛋白的功能研究，有的已经取得重要进展，有的尚在积极研究之中。
四、CDK和CDK抑制因子
当酵母Cdc2和Cdc28基因被分离出来后，几个实验室便立即着手Cdc2或Cadc28类同基因的分离工作。他们首先通过PCR技术构建了人类、非洲爪蟾和果蝇的cDNA文库，然后对DNA文库进行筛选。结果成功分离到了十多个Cdc2相关基因。通过基因序列和蛋白质功能分析，证明有的确实是Cdc2类同基因，与酵母Cdc2基因相比较，不仅同源性强，在蛋白质功能方面也有很强的互补性。也有的不仅在序列方面与Cc2有一定差异，在蛋白质功能方面也表现出一定的特殊性。但是，它们又含有两个共同的特点 个是它们含有一段类似的氨基酸序列，另一个是它们都可以与周期蛋白结合，并以周期蛋白作为调节亚基，进而表现出蛋白激酶活性。因而，它们被统称为周期蛋白依赖性蛋白激酶( cyclin- dependent kinase，cdK)。目前在人体中已发现并被命名的CDK包括Cdc2、Cdk2cdk13等。由于Cdc2第一个被发现，而其他几个CDK则是通过与其相比较而得来，因而Cdc2激酶被命名为Cdk1。不同的CDK所结合的周期蛋白不同，在细胞周期中执行的调节功能也不相同。对不同的CDK的功能认识，有的比较清楚，有的正在深入。某些CDK与周期蛋白的配对关系，见表13-1。
各种CDK分子均含有一段类似的CDK激酶结构域( CDK kinase domain)。与Cdkl激酶结构域相比，其他几种CDK激酶结构域的保守程度有所不同(图13-6)。但是，在CDK激酶结构域中，有一小段序列则相当保守，即 PSTAIRE序列。据认为，此序列与周期蛋白结合有关。此外，在CDK分子中也发现一些重要位点。对这些位点进行磷酸化修饰，将对CDK活性起重要调节作用。细胞内存在多种因子，对CDK分子结构进行修饰，参与CDK活性的调节。
除周期蛋白和上述修饰性调控因子对CDK活性进行调控之外，细胞内还存在一些对CDK活性起负调控的蛋白质，称为CDK抑制因子( cyclin- -dependent kinase inhibitor.)。到目前为止，已经发现多种对CDK起负调控作用的CKI，分别归为CiKip家族和INK4家族。Cip/Ki家族成员主要包括p21pn、p27和p572，其中p21mn为此家族的典型代表。p21主要对G1期C(Cdk2、dk3、cdk4和Cdk6)起抑制作用。p21还可以与Pca( proliferating cell nuclear antigen)直接结合。PCNA是DNA聚合酶δ的辅助因子，为DNA复制所必需。p21与PCNA结合，可以直接抑制DNA复制。INK4家族成员主要包括p16、p15p18和p19等，p16为此家族的典型代表。p16主要抑制Ck4和Cdk6活性。
五、细胞周期运转调控
目前已经公认，CDK对细胞周期运行起着核心性调控作用，因此将其称为周期引擎分子( engine molecule)。不同种类的周期蛋白与不同种类的CDK结构成不同的CDK。不同的CDK在细胞周期的不同时期表现活性，因而对细胞周期的不同时期进行调节。例如，与G1期周期蛋白结合的CDK在G1期起调节作用，与M期周期蛋白结合的CDK在M期起调节作用。
(一)G2M期转化与Cdk1的关键性调控作用
如上所述，Ck1即MPF，或p342激酶，由p34d2(或p34)蛋白和 cyclin B结合而成。p34d2蛋白在细胞周期中的含量相对稳定，而 cyclin B的含量则呈现周期性变化。p34蛋白只有与 cyclin B结合后才有可能表现出激酶活性。因而，Cdk1活性首先依赖于 cyclin B含量的积累。 cyclin B一般在G1期的晚期开始合成，通过S期，其含量不断增加，到达G2期，其含量达到最大值。随 cyclin B含量积累到一定程度，Cdk活性开始出现。到G2期晚期阶段，Cdk1活性达到最大值并一直维持到M期的中期阶段。Cdk1活性和 cyclin B含量的关系(图13-7)。 cyclin A也可以与Cdk1结合成复合体，表现出CDK1活性。
Cd1通过使某些底物蛋白磷酸化，改变其下游的某些靶蛋白的结构和启动其功能，实现其调控细胞周期的作用。Cdk1催化底物磷酸化有一定的位点特异性，选择底物中某个特定序列中的某个丝氨酸或苏氨酸残基。Cdk1可以使多种底物蛋白磷酸化，其中包括组蛋白H1，核纤层蛋白A、B、C，核仁蛋白( nucleolin)，N38，p60，c-b等(表13-2)。组蛋白H磷酸化，促进染色质凝缩；核纤层蛋白磷酸化，促使核纤层解聚；核仁蛋白磷酸化，促使核仁解体；p60蛋白磷酸化，促使细胞骨架重排；c-Ab蛋白磷酸化，促使细胞形态调整等。
CDK活性受到多种因素的综合调节。周期蛋白与CDK结合是激活CDK活性的先决条件。但是，仅周期蛋白与CDK结合，并不能使CDK激活。还需要其他几个步骤的修饰，才能表现出激酶活性。首先，当周期蛋白与CDK结合形成复合物后，Weel/Mik1激酶和CDK活化激酶(Cdk- activiting kinase)催化CDK第14位的苏氨酸(Thr14)、第15位的酪氨酸(Tyr15)和第161位的苏氨酸(Thr161)磷酸化。但此时的CDK仍不表现激酶活性(称为前体MPF)。然后，CDK在蛋白磷酸水解酶Cdc25C的催化下，使其Thr14和Tyr15去磷酸化，才能表现出激酶活性。cdk1活性调控见图13-8。
在体外培养的细胞和单细胞生物中，CDK活性是细胞生命活动所需要的。解除CDK活性，往往导致细胞生命活动停滞和死亡。但在小鼠中，敲除些被认为是细胞生命活动所必需的CDK活性， ，如Cdk2、cdk4、cdk6、 cyclin A、 cyclin E、 cyclin D等，动物可以存活，因而推测CDK之间可以代偿一些功能。CDK活性敲除实验也揭示了CDK在个体发育等方面的功能。例如，Cdk4敲除小鼠个体矮小，内分泌器官发育不良，导致糖尿病和不育等。dk6敲除小鼠个体不正常，脾和胸腺发育不全，某些T淋巴细胞类群对抗原的应答滞后等。Cdk2敲除小鼠不育。由此可见，细胞周期调控因子对生物体个体和器官的发育也起着重要调节作用。
二)M期周期蛋白与细胞分裂中期向后期转换
细胞周期运转到分裂中期后，M期 cyclin A和B将迅速降解，Cdk活性丧失，上述被Cdk1磷酸化的靶蛋白去磷酸化，细胞周期便从M期中期向后期转化。目前已经知道， cyclin A和B的降解是通过泛素化依赖途径实现的。
如前所述，伴随 cyclin-CDK复合物形成，CDK亚基Thr14、Tyrl5和Thr161残基磷酸化，以及Thr4和Tyr5去磷酸化， cyclin-CK复合物激酶活性表现出来，Thr161位点保持磷酸化状态是Cdk1活性表现所必需的(图13-8)。有丝分裂中期过后，周期蛋白与CDK分离，在APC的作用下，M期 cyclin A和B通过泛素化依赖途径被蛋白酶体降解(参见图5-2由泛素和蛋白酶体所介导的蛋白质降解途径)。M期周期蛋白在泛素化途径降解过程中，其分子中的破坏框起着重要的调节作用。用基因突变方法将破坏框去除，所得到的突变分子将不能被泛素化途经所降解，因而可以较长时间地保持活性。
1995年，两个实验室率先分离并部分纯化了具有E3活性的蛋白质复合物。首先，V. Sudakin等人在青蛙卵中分离到了一个分子质量为1500kDa的蛋白质复合物，称为 cyclosome。 在E1、E2、泛素和ATP再生体系存在的情况下， cyclosome可以在体外将 cyclin A和B通过泛素化途径降解。几乎与此同时，R.W.King等人在非洲爪蟾卵中分离到了一个20S的蛋白质复合物，即后期促进复合物( anaphase-promoting complexAPC)，也支持 cyclin B通过泛素化途径体外降解。此后证明， cyclosome和APC为同源物，而APC这一名词则更广为应用。APC的发现是细胞周期研究领域中又一大进展，表明细胞分裂中期向后期转换也受到精密调控。进一步研究证明，APC至少有15种成分组成，分别称为Apc1-Apc15。这些蛋白质成分在不同物种中大部分已鉴定出来，如在人体中已鉴定了ApclApc8，Apc10—aApc13，以及dc26等13种，在芽殖酵母和裂殖酵母中也已分别鉴定出了13种APC成分。在不同物种中鉴定的15种成分中，有的为过去已知的成分，如Cdc16、Cdc23、Cdc27和BimE等，有的为未知成分。S. Tugendreich等人(1995)克隆了人类的Cdc6和Cdc27基因，并证明Cdc16s和Cdc27Hs蛋白位于哺乳动物细胞的中心体和纺锤体上。用抗Cdc27Hs的抗体进行显微注射，可以将细胞抑制在分裂中期。在非洲爪蟾体系中，用抗Cdc27Hs的抗体处理上述20S的APC，可以使APC的泛素化活性丧失。在 Kim Nasmyth实验室工作的另一些科学家则在芽殖酵母细胞中证明，Cdc16和Cdc23也为 cyclin B的降解所必需。BimE基因最早发现于构巢曲霉( (Aspergillus nidulans)温度敏感突变株bim7。bimE7细胞在正常温度下可以正常生活，若放到限定温度下培养，BimE7基因会发生突变，引起细胞早熟性地进入分裂期。即使用药物处理，将细胞先抑制在S期，然后再放到限定温度下培养，也会引起细胞早熟性地进入分裂期，说明BimE是一种细胞分裂负调控因子。对BimE的确切作用机制，目前尚不甚清楚。APC除了调节M期周期蛋白泛素化依赖降解途径外，还调节其他一些与细胞周期调控有关的非周期蛋白类蛋白质的降解，如裂殖酵母中的Cut2和芽殖酵母中的 Pdslp等。已知Cut2和 Pdslp均为细胞分裂由中期向后期转换的负调控因子。
了解APC活性变化是认识细胞周期由分裂中期向后期转换的关键问题之一。APC活性受到多种因素的综合调节。目前已知，细胞中存在正、负两类APC活性调节因子。激活APC的正调控因子有Cdc20/ /Fizzy和 CahI/Fzy等，负调控因子有Emil、Emi2、Mad2BubR1等。首先，已知各类APC在分裂间期中表达，但只有到达M期后才表现出活性，提示M期CDK激酶活性可能对APC的活性起着调节作用。体外实验显示，APC可以被活化的M期CDK所激活，且多种APC作为底物被M期CDK磷酸化；而活化的APC则可以被蛋白磷酸水解酶作用而失活。其次发现，Cdc20为APC有效的正调控因子。Cdc20主要位于染色体动粒上，为姐妹染色单体分离所必需。APC活性亦受到纺锤体组装检查点( spindle assembly checkpoint)的调控。纺锤体组装不完全，或所有动粒不能被动粒微管全部捕捉，APC则不能被激活。目前已经知道，在纺锤体组装调控过程中，Mad2( mitosis arrest deficient2)蛋白起着重要作用。正常情况下，Mad2定位在早中期和错误排列的中期染色体的动粒上，纺锤体组装不完全，动粒不能被动粒微管捕捉，Mad2则不能从动粒上解离下来因此，Mad2蛋白为细胞延迟进入后期提供了一种“等待”信号。Mad2与Cdc20结合，有效地抑制Cdc20的活性。当纺锤体组装完成以后，动粒全部被动粒微管捕捉，Mad2从动粒上消失，从而解除对Cdc20的抑制作用，促使APC活化，导致M期周期蛋白降解，M-CDK活性丧失；在酵母细胞中，促使Cut2 /Pdslp降解，解除其对姐妹染色单体分离的抑制，细胞则由中期向后期转化。
(三)G1/S期转化与G期周期蛋白依赖性CDK细胞由G1期向S期转化是细胞增殖过程中的关键事件之一。细胞能否成功地实现由G1期向S期转化，标志着该细胞能否完成其DNA复制和其他相关生物大分子的合成，进而完成细胞分裂。目前一般认为，细胞由G1期向S期转化主要受G1期周期蛋白依赖性CDK所控制。在哺乳动物细胞中，G1期周期蛋白主要包括 cyclin D、E，或许还有 cyclin A。与G1期周期蛋白结合的CDK主要包括Cdk2、Cdk4和Cdk6等。 cyclin D主要与cdk4和Cdk6结合并调节后者的活性，而 cyclin E则与Cdk2结合。 cyclin A常被认为属M期周期蛋白，但 cyclin A也可与Cdk2结合使后者表现激酶活性，提示 cyclin A可能参与调控GS期转化过程。
目前已知哺乳动物细胞中表达三种 cyclin D，即D1、D2和D3，但三者的表达有细胞和组织特异性。据推测，在快速增殖的细胞中至少表达一种 cyclin D。一般情况下，一种细胞仅表达两种 cyclin D，即D3和D1或D2。在细胞水平上所做的实验，包括特异的抗 cyclin D的抗体显微注射和反义RNA显微注射等，显示 cyclin D为细胞GS期转化所必需。 cyclin D-cdk4和 cyclin D-cdk6不能使组蛋白Hl磷酸化。对 cyclin DCDK的底物仍已知甚少，目前仅知道Rb蛋白( retinoblastoma protein，成视网膜细胞瘤蛋白)为其底物。Rb蛋白是E2F的抑制因子，在哺乳类G1期细胞中起“刹车”作用，因此Rb蛋白是G1/S期转化的负调控因子，在G1期的晚期阶段通过磷酸化而失活
cyclin E是哺乳类细胞中表达的另一种G1期周期蛋白。它在G1期的晚期开始合成，并一直持续到细胞进入S期。当细胞进入S期后， cyclin E很快即被降解。 cyclin E与dk2结合形成复合物，呈现Cdk2活性。因而， cyclin E-Cdk2活性峰值时间为G1期晚期到S期的早期阶段。大量实验显示， cyclin E-dk2活性为S期启动所必需。在果蝇胚胎发育过程中，如果将 cyclin E进行基因突变，该胚胎的细胞则被阻止在G1期。将抗 cyclin E的特异抗体做细胞显微注射，被注射的细胞便停留在G1期。用非洲爪蟾卵提取物进行细胞核重建和DNA复制实验，如果事先将 cyclin E从卵提取物中用免疫沉淀方法去除，重建的细胞核不能复制DNA。在哺乳动物细胞中，TGFβ是一种生长抑制因子。有实验表明， cyclin E-Cdk2是TGF作用的主要靶酶。TGβ可以有效地抑制 cyclin E-cdk2活性，进而将细胞阻止在G1期。也有一些证据显示， cyclin E在肿瘤细胞中的含量比正常细胞中要高得多。在细胞中提高 cyclin E的表达，该细胞则快速进入S期，而且对生长因子的依赖性降低。
实验表明， cyclin E-cdk2可以与类Rb蛋白p107和转录因子E2F结合形成复合物。与Rb蛋白相似，p107可以将SAOS细胞抑制在G1期。而E2F则可以促进与G1/S期转化和DNA复制有关的基因转录。一般认为，当 cyclin E-cdk2激酶与p107和E2F结合形成复合物之后，Cdk2催化p107磷酸化，使p107失去抑制作用，则E2F的作用被显现出来，促进有关基因的转录，从而促使细胞周期由G1期向S期转化。此外，最近有几个实验室相继证明， cyclin E-dk2直接参与了中心体复制的起始调控。
cyclin A也可以与Cdk2结合，形成 cyclin A-dk2 cyclin A的合成开始于GS期转化时期。进入S期后， cyclin A-cdk2激酶成为该时期主要的CDK。目前有实验显示 cyclin A-cdk2与DNA复制有关。在S期， cyclin A-cdk2复合物位于DNA复制中心。将抗 cyclin A的抗体注射到细胞中将抑制细胞DNA的合成。在体外， cyclin A-cdk2可以使DNA复制因子RF-A磷酸化并使其活性增强。此外， cyclin A-cdk2也可以与p107和E2F结合形成复合物，进而影响E2F促进基因转录的功能到达S期的一定阶段，G1期周期蛋白也是通过泛素化依赖途径降解的，但与M期周期蛋白的降解有所不同。G1期周期蛋白的降解是通过SCF(Skp- -culin-F box protein)泛素化途径降解的，同时需要G1期CDK活性的参与。G1期周期蛋白分子中不含有破坏框序列而是含有PEST序列。PEST序列对G1期周期蛋白降解起促进作用。此外 些参与DNA复制的调控因子如Cdt1和Orc1，以及CDK抑制因子如p21、p27和p57等，也是通过SCF泛素化依赖途径降解的。SCF通过降解细胞周期的不同时期的不同的底物从而在整个细胞周期中都发挥作用(图13-9)。SCF是一种由多亚基构成的蛋白复合物，具有E3泛素连接酶的功能。SCF主要由Skp1、Cull和Rbx三种亚基构成，可以被Skp2Fbw7和βTrCP三种Fbox蛋白分别活化，催化底物蛋白的泛素化。SCF的底物特异性的识别是由F-box蛋白来决定的(图13-10)。
除G1期周期蛋白依赖性CDK活性之外，细胞内还存在其他多种因素对DNA复制起始活动进行综合调控。首先，DNA复制起始点的识别，是DNA复制调控中的重要事件之一。已经发现，从酵母细胞到高等哺乳类细胞，均存在一种多亚基蛋白复合物，称为复制起始点识别复合物( (origin recognition complex，OrC)。ORC含有6个亚基，分别称为OrC1—Orc6。ORC识别DNA复制起始位点并与之结合，是DNA复制起始所必需的。其次，Cdc6和Cdc45也是DNA复制所必需的调控因子。如果将Cdc6和Cdc45去除，DNA便不能起始复制。Cdc6在G1期早期与染色质结合，到S期早期从染色质上解离下来。Cdc45约在G1期晚期才与染色质结合，Cdc6对Cdc45与染色质结合起促进作用，但尚不知道是起直接作用还是间接作用。另外，在20世纪80年代末，人们还提出了一种“DNA复制执照因子学说”( DNA replication-licensing factor theory)，并在此后的研究中取得突破性进展。人们早已知道，在整个细胞周期中DNA复制一次，而且只能一次。是什么因素控制细胞在一个细胞周期中DNA只能复制一次呢?为此， J. Bow和r. Laskey通过实验提出，在细胞的胞质内存在一种执照因子，对细胞核染色质DNA复制发行“执照”( (licensing)。在M期，细胞核膜破裂，胞质中的执照因子与染色质接触并与之结合，使后者获得DNA复制所必需的“执照”。细胞通过G1期后进入S期，DNA开始复制。随DNA复制过程的进行，“执照”信号不断减弱直到消失。到达G2期，细胞核不再含有“执照”信号，DNA复制结束并不再起始。
只有等到下一个M期，染色质再次与胞质中的执照因子接触，重新获得“执照”，细胞核才能开始新一轮的DNA复制。DNA复制执照因子是一种什么物质呢?提纯工作发现，Mcm蛋白( minichromosome mantenance protein)是其主要成分。Mm蛋白共有6种，分别称为Mcm2、Mcm3、Mcm4、Mcm5、cm6和Mcm7。在细胞中去除任何一种Mcm蛋白，都将使细胞失去DNA复制起始功能。除Mcm蛋白之外，执照因子中还包括其他某些成分，但目前还不清楚。关于ORC、Cdc6Cdc45和Mcm蛋白在与染色质结合过程中的相互关系，见图13-11
(四)S/G2/M期转换与DNA复制检查点
DNA复制结束，细胞周期由S期自动转换到G2期，并准备进行细胞分裂。然而，为什么在DNA复制尚未完成之前，细胞不能开始S/G2M期转化呢?原来，细胞中存在一系列检查DNA复制进程的监控机制。DNA复制还未完成或者DNA复制出现问题，细胞周期便不能向下一个阶段转换。DNA复制检查点主要包括两种：S期内部检查点(inta-s Dhase checkpoint)以及DNA复制检查点( replication checkpoint)(图13-12)。
S期内部检查点是指在S期内发生DNA损伤如DNA双链发生断裂时，S期内部检查点被激活，从而抑制复制起始点的启动，使DNA复制速度减慢，S期延长，同时激活DNA修复和复制叉的恢复等机制。S期内部检查点是通过两条信号通路来实现的。一条通路是通过染色体结构维持蛋白Smc1的磷酸化，从而实现S期的延长。而Smc1的磷酸化则依赖于ATMMdc-mrnc( Mrell-rad50-nbs1 complex)等中介物的系列催化过程。然而，磷酸化的Smc1是如何促使DNA复制停滞的，目前仍然不太清楚。另一条通路是通过ATM/ATR介导的Cdc25A磷酸酶过磷酸化而降解，从而抑制 cyclin Ea-cdk2活性。 cyclin E/ACdk2受到抑制后，阻止Cdc45在仍未起始复制的复制起始点上的募集。Cdc45是DNA解旋酶Mcm2-7的关键的激活因子，因而这种方式能够抑制未起始复制的复制起始点。
另外一种是由于停滞的复制叉导致的S期的延长，被称为DNA复制检查点。DNA复制检查点主要是由AT/Chk1激活来介导的。尽管对该机制中AT/Chk1的底物还了解得很少，而ATR/Chk1介导的Cdc25A降解进而抑制 cyclin E/A-Cdk2的通路在减缓整体DNA复制的效率中应该起到一定作用(图1312)。许多处于复制叉上的复制蛋白都是ATR的底物并且被ATR磷酸化，它们包括RFC复合体( replication factor C complex)、pa和Rpa2、Mcm27复合体Mcm10，以及一些DNA聚合酶。然而，这些磷酸化事件的功能大部分都不清楚。
六、其他因素在细胞周期调控中的作用
除上述各种因素参与细胞周期调控之外，还有不少其他因素参与细胞周期调控，其中最为重要的一类因素为癌基因和抑癌基因。癌基因和抑癌基因均是细胞生命活动所必需的基因，其表达产物对细胞增殖和分化起着重要的调控作用。癌基因异常表达可导致细胞转化、增殖失控，甚至细胞癌变。目前已经分离了百多种癌基因，其表达产物大致可归纳为蛋白激酶多肽类生长因子、膜表面生长因子受体和激素受体信号转导器、转录因子、类固醇和甲状腺激素受体核蛋白等几个类型。它们在细胞周期信号调控过程中各自起着不同的作用。例如，生长因子与细胞表面的生长因子受体结合，可以促使G期的细胞返回细胞周期，开始细胞增殖。抑癌基因表达产物对细胞增殖起负调节作用，如p53、Rb等。p53是近年来研究较多的人类抑癌蛋白之一。p53基因突变，使细胞癌变的机会大大增加，已经证实，有许多肿瘤同时伴随p53基因突变。
除细胞内在因素外，细胞和机体的外在因素对细胞周期也有重要影响，如离子辐射、化学物质作用、病毒感染、温度变化、pH变化等。离子辐射对细胞最直接的影响之一是DNA损伤。DNA损伤后，细胞会很快启动其DNA损伤修复调控体系，抑制细胞周期运转，直到DNA损伤得以完全修复；或者最终不能完成修复，致使细胞走向死亡。在人类细胞DNA损伤修复过程中，p53表达水平大大提高，通过一些下游调控因子，抑制Cdk、cdk2、Cdk4等激酶活性，从而影响细胞周期运转。化学物质种类繁多，有的可直接参与调控DNA代谢，影响细胞周期变化；有的可以通过其他途径，影响酶类和其他调节因素的变化，改变细胞周期进程。病毒感染也是影响细胞周期进程的主要因素之一。有的病毒感染能快速抑制细胞周期，有的则可以诱导细胞转化和癌变，使整个细胞周期进程发生改变。
