第二节 细胞程序性死亡
多种形式的细胞死亡及其生物学意义
但凡生命，最终都会死亡，细胞作为生命的基本单位也不例外。区别于物理或化学因素导致的随机被动性死亡，如高温使得生物大分子瞬间发生化学改变而导致的细胞死亡，细胞具有内在遗传机制控制的主动性死亡方式，称为程序性死亡( programmed cell death，PCD)。
细胞程序性死亡是维持生物体正常生长发育及生命活动的必要条件，其重要性不亚于细胞的增殖。现在发现细胞程序性死亡的形式多种多样，其形态特征、分子机制和生理效应各异，如动物细胞的凋亡、程序性坏死，植物细胞的程序性死亡等，但均受到某些基因的控制，经历一系列有序的信号传递。细胞以何种形式“结束生命”取决于细胞类型、生理状态、周围环境以及外界刺激等多种因素。
(一)凋亡
动物细胞的调亡是研究得最为深入的程序性死亡方式。早在1885年德国生物学家 Flemming就曾描述过卵巢滤泡细胞的凋亡形态特征。他观察到细胞死亡时伴随染色质的水解，因此将这种细胞死亡称作“染色质溶解”( chromatolysis)。80年后的1965年，澳大利亚病理学家J.Ker观察到结扎大鼠肝门静脉后，在局部缺血的情况下，大鼠肝细胞连续不断地转化为小的圆形的细胞质团，从周围的组织中脱离。这些细胞质团由质膜包裹，内含细胞碎片(细胞器和染色质等)。在这一过程中死亡细胞的质膜及溶酶体保持完整，细胞内含物不会释放到膜外，不会诱导机体发生炎症反应。1972年Ker将
这一现象命名为细胞凋亡( apoptosis)。“ apoptosis”一词源自古希腊语，意指花瓣或树叶的脱落、凋零，这命名意在强调这种细胞死亡方式是正常的生理过程。此后，研究者们在各种生理或病理过程中发现了凋亡现象的存在。三位学者S. Brenner、J. Sulston和R. Horvitz以线虫的发育为研究模式，利用一系列突变体，发现了发育过程中控制细胞凋亡的关键基因，使原先侧重于形态学描述的细胞凋亡概念在基因水平上得以阐释，即细胞凋亡是受基因调控的主动的生理性自杀行为。三人因此获得了2002年诺贝尔生理学或医学奖。此后，对细胞凋亡分子机制的解析迅速展开，成为20世纪90年代生命科学的一大研究热点。
细胞凋亡具有重要的生理意义，主要表现在如下几个方面：
(1)保证正常的胚胎发育进程，塑造个体及器官形态，形成免疫耐受。在动物个体发育的组织形成时期，开始往往制造数量过多的细胞，继而再依据需求选择最后留存的功能细胞，而多余的细胞通过细胞凋亡去除(图15-3)。例如在脊椎动物神经系统的发育过程中，约有50%的原始神经元存活并且与靶细胞建立了连接，而没有建立连接的神经元则发生凋亡。这与靶细胞(肌细胞)分泌的一种存活因子神经生长因子( nerve growth factor，NGF)有关。只有接受了足够量存活因子的神经元才能生存，其它的神经元则发生凋亡。动物体通过这种方式来调节神经细胞的数量，使之与需要支配的靶细胞数量相适应，以最终建立正确的神经网络联系(图15-4)。
细胞凋亡是塑造个体及器官形态的途径之一。哺乳动物指(趾)间蹼的消失、颚融合、肠腔管道的形成视网膜发育等过程都必须有细胞凋亡的参与。动物蜕变过程中幼体器官的缩小和退化(如蝌蚪尾的消失等)也是通过细胞凋亡来实现的细胞凋亡还参与了免疫耐受的形成。例如胸腺细胞经过一系列的发育进程成为各种类型的免疫活性细胞同时通过细胞凋亡，对识别自身抗原的T细胞克隆进行选择性消除。这样形成了既有免疫活性又对自身抗原免疫耐受的淋巴细胞。
(2)维持生物体内的自稳态。Ker等建立细胞凋亡的概念时就提出：“细胞凋亡降低细胞数量，细胞分裂增加细胞数量，同为控制细胞族群大小的两大原动力。”
细胞凋亡不诱发炎症，是“安全”的细胞死亡方式。动物成体通过调节细胞凋亡和增殖的速率来维持组织器官细胞数量的稳定以及成体细胞的自然更新。健康成人体内每秒分裂产生约十万个新细胞，同时有相当数量的细胞发生凋亡。正常的T淋巴细胞在受到入侵的抗原刺激后被激活，产生免疫应答。机体为了防止免疫过激，会通过诱导T细胞凋亡来控制T细胞的寿命。细胞凋亡不足会导致多种疾患，例如在自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)患者体内，增生的T淋巴细胞无法正常凋亡，造成淋巴细胞增殖性的自身免疫病。另一方面，细胞凋亡过度也会导致组织器官功能缺失。例如人免疫缺陷病毒HⅣ特异性感染CD4T淋巴细胞，能够直接诱发T细胞凋亡或使其对凋亡信号的敏感性增强，致使T细胞相关的免疫功能缺陷，极大地增加了艾滋病患者机会性感染及肿瘤的发生概率。多种急慢性疾病如败血症肌梗死、急性肝损伤、亨廷顿病，以及神经退行性疾病帕金森病、阿尔茨海默病等都与细胞的过度凋亡相关目前知道阿尔茨海默病的发生主要是由于海马及基底神经核内的神经细胞大量丧失，其原因可能是β-淀粉样蛋白过量表达，沉积于神经组织内，激活周围的吞噬细胞释放炎症因子，促进神经细胞凋亡的发生，从而导致神经细胞的大量丧失。
(3)生理保护，肿瘤监控。细胞凋亡能够清除体内受损或危险的细胞而不对周围的细胞或组织产生损害。例如杀伤性T淋巴细胞能够分泌一种细胞因子Fas配体，与被病原体感染的细胞表面的死亡受体Fas蛋白结合，启动细胞内的凋亡程序，使被感染细胞发生凋亡(见后文)。一些细胞在受损伤或受胁迫的情况下能够同时产生Fas配体和Fas蛋白，导致自身的凋亡。
凋亡也是机体预防癌症发生的重要手段。DNA损伤等致癌因素会诱发细胞凋亡，遏制细胞的癌变。临床研究发现，相当多的恶性肿瘤细胞的正常凋亡机制受到抑制，使机体不能早期清除可能有癌变危险的细胞。例如哺乳动物中第一个被发现的凋亡抑制基因Bcl2在滤泡淋巴瘤( follicular lymphomas)细胞中高表达。由于染色体重排，Bcl2基因的编码区与免疫球蛋白的增强子相连，导致Bcl2蛋白的过量表达，使肿瘤细胞能够免于凋亡，持续增殖。
(二)程序性坏死
坏死( necrosis)一词源于希腊语“ nekros”，意为尸体。19世纪初被用于描述外科手术中观察到的组织溃烂，后来用于描述病理性的细胞死亡。细胞坏死具有与细胞凋亡迥然不同的特征：细胞膜破裂，细胞内含物释放，周围组织发生炎症反应，动物血液中可检测到原本定位于细胞内部的分子，如细胞核内的高速泳动族蛋白B1( nuclear high mobility group box1 protein)和线粒体DNA等。作为机体内源性的危险信号，这些分子被称为损伤相关分子模式( damage- associated molecular pattern，DAMP)，对应于病原体入侵产生的外源性危险信号：病原相关分子模式( pathogen- -associated molecular pattern，PAMP)，如细菌或病毒的核酸及蛋白质成分。
细胞坏死曾长期被认为是一种区别于细胞凋亡的被动的细胞死亡方式。近年的研究确立了细胞程序性坏死( programmed necrosis)的概念，即与细胞凋亡类似这种细胞膜破裂的死亡过程，也受到细胞内特异基因的控制。现在发现程序性坏死可以由不同信号触发，由细胞内不同的信号传递分子介导。
典型的程序性坏死证据来自于肿瘤坏死因子( tumor necrosis factor，TNF)的效应。TNF是一种多效的细胞因子，在感染和损伤诱导的机体炎症发生过程中发挥重要作用。通过它的主要受体TNFR1(TNF receptor1)可以诱导多种炎症因子的表达及某些敏感细胞的死亡，包括质膜保持完整的凋亡和质膜破裂的坏死两种形式；当细胞内的凋亡信号通路受阻或不完整时，TNF诱导的细胞坏死现象就变得非常明显(图15-5)。2005年袁钧瑛研究团队将这种细胞死亡方式命名为necroptosis”。2009年包括韩家淮和王晓东在内的三个研究团队，发现并报道了激酶RIPK( receptor interacting kinase)家族成员RPK3在 necroptosis信号通路中发挥重要作用(见后文)。以上研究证明细胞坏死是可调控的，即确立了程序性坏死的概念。
另一种程序性坏死的方式是细胞焦亡( pyroptosis)，与细胞的免疫反应密切相关。20世纪80年代发现，某些细菌感染巨噬细胞会导致伴随大量炎性因子释放的死亡，2001年这种死亡方式被命名为“ pyroptosis。pyro”在希腊语中表示“发热”，暗示这种细胞死亡方
式导致炎症。细胞焦亡表现为，受到病原体感染后，细胞膜在短时间内形成孔洞，细胞膨胀至细胞膜破裂，白介素1B( (interleukin-1B，L1B)等炎性因子大量释放激活机体产生强烈的炎症反应并诱导免疫吞噬作用，破裂的细胞膜包裹着细菌等病原体被吞噬细胞吞噬消灭。
2015年邵峰硏究团队等解析了介导细胞焦亡的关键信号分子(见后文)，再次确认了细胞程序性坏死的概念由于缺乏特异性的分子标记和抑制剂，目前对程序性坏死生理功能的了解还较为有限。程序性坏死可能在机体免疫反应中发挥重要作用。一方面，细胞感染病原体后如果需要通过“自杀”方式消灭病原体，由于某种原因凋亡不能正常发生时，程序性坏死可以作为调亡的“替补”方式被细胞采用。已发现病毒为了保障复制顺利完成，防止宿主细胞提前“自杀”，除了携带抑制凋亡的基因，还会携带抑制坏死的基因，这从侧面证明程序性坏死是细胞抗感染的途径之一。另一方面，被感染的细胞发生坏死后，来自细胞和病毒的内源外源损伤信号DAMP、PAMP释放出来，能够强烈促发免疫反应，有利于机体对病原体发动更有效的进攻。但若干人类疾病包括急性肝损伤、急性胰腺炎、系统性炎症等也涉及不受控制的细胞坏死。深入解析细胞坏死的分子机制可能有助于这些疾病治疗药物的开发。
(三)植物细胞的程序性死亡
最早关于植物细胞程序性死亡的相关报道发表于1994年，研究者在拟南芥的超敏反应中发现类似动物细胞凋亡的现象，之后逐渐证明细胞程序性死亡在植物中也广泛存在。主要生理功能包括：①植物防御病原体的反应或称超敏反应( hypersensitive response，HR)。植物在病原体侵染部位发生细胞程序性死亡，阻止病原体侵染其他部位。②植物对环境胁迫的反应，如缺氧、高盐等引发细胞程序性死亡。③在植物发育进程中发挥作用。
如配子体发育过程中非功能性大孢子的死亡，绒毡层细胞的死亡；种子发育早期珠心的退化，胚乳、胚柄、种皮的发育，根冠的形成，维管组织的形成等。例如木质部管状细胞( tracheary element，TE)是植物体负责运输及机械支持的厚壁组织细胞，管状细胞的成熟包括细胞伸长、细胞壁增厚、木质化和细胞程序性死亡过程。
植物细胞程序性死亡的方式与动物细胞差别较大植物细胞被固定在细胞壁中，没有类似动物巨噬细胞的可移动细胞来清除死亡残余物，因此植物细胞往往利用溶酶体(液泡)中的水解酶来消化分解死亡细胞，主要包括两种方式：①植物细胞内液泡膜破裂，水解酶释放出来消化细胞内含物，整个细胞被迅速直接地分解而死亡。这种方式的细胞死亡一般发生在植物发育进程中。②液泡膜与细胞膜发生融合，水解酶释放到细胞外触发细胞死亡。植物被细胞外复制的病原体感染时会诱发这种反应，往往在消灭病原体的同时引发间接的细胞死亡。
二、细胞凋亡的过程及分子机制
在已知的各种细胞程序性死亡方式中，人们对细胞凋亡了解得最为深入。下面重点介绍凋亡的生物学特征及分子机制。
典型动物细胞的凋亡过程，在形态学上可分为三个阶段(图15-6A)：
(1)凋亡的起始。细胞表面的特化结构如微绒毛等消失，细胞间连接消失，细胞质中核糖体逐渐与内质网脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；细胞核内染色质固缩凝集，形成新月形帽状结构，沿着核膜分布(图15-6B，图15-7)。这一阶段历时数分钟，然后进入第二阶段。
(2)凋亡小体的形成。核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体等聚集在一起，被反折的细胞质膜包裹，形成膜包裹的球形结构，称为凋亡小体( apoptotic body)。扫描电镜下可以观察到细胞表面产生许多泡状或芽状突起，随后逐渐脱离细胞，形成单个的凋亡小体。
(3)凋亡小体被吞噬。凋亡小体逐渐被邻近细胞或巨噬细胞吞噬，在溶酶体内被消化分解。
细胞凋亡发生的整个过程中，细胞内含物始终被膜包裹，不泄漏到细胞外，因此不会引发机体的炎症反应。凋亡的过程往往很迅速，从细胞凋亡启动到凋亡小体的出现不过数分钟，大约半小时到几个小时后，整个凋亡细胞便被吞噬灭迹。因此细胞凋亡虽然是机体中频繁发生的生理现象，但在组织学水平上却难以观察到，也正是由于这个原因迟迟未引起早期研究者们的注意。
在分子水平上，细胞凋亡过程包括接受凋亡信号、凋亡相关分子的活化、凋亡的执行、凋亡细胞的清除4个阶段。蛋白酶 caspase( cysteine aspartic acic specific protease)家族成员在其中发挥了重要作用，大部分凋亡过程依赖于 caspase的活性，称为 caspase依赖性凋亡( caspase dependent apoptosis)。 caspase失活或者被抑制，细胞凋亡往往不能发生。
- caspase及其基本类型简介
caspase是一组天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶，存在于细胞质中。它们的活性位点均包含半胱氨酸残基，能够特异地切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键，切割的结果是使靶蛋白活化或失活，而非完全降解。
caspase的发现源于秀丽隐杆线虫( Caenorhabditis elegans)发育的研究。线虫从胚胎发育到成体的过程中共产生1090个体细胞，其中131个体细胞发生凋亡后消失。1986年美国麻省理工学院 Horvitz实验室发现，当Ced3或Ce4突变后，原先应该凋亡的131个细胞依然存活；与之相反，Ced9的突变导致所有细胞在胚胎期死亡，无法得到成虫。这一结果证明，Ced3和Ced4是线虫发育过程中细胞凋亡的必需基因，Ced9的功能是抑制细胞凋亡。线虫凋亡基因的发现促进了哺乳动物细胞凋亡机制的研究。胎生哺乳动物 caspase家族成员有十余种(表15-1)，按照功能可以分为两大类：①炎症 caspase，包括 caspase-1、4、5、11、12，负责产生有活性的白介素1( interleukin-1，L1)。I1和肿瘤坏死因子TNF都是重要的炎症因子，与TNF不同的是，I1表达量的调控主要发生在翻译后阶段。L1前体蛋白需要被 caspase在特异位点切割后才成为成熟有活性的细胞因子被分泌到细胞外。②凋亡 caspase，包括 caspase-2、3、6、7、8、9、10，负责介导细胞凋亡。按照在凋亡过程中发挥的不同功能，凋亡 caspase又可分为两类：起始 caspase和效应 caspase。起始酶( caspase-2等)负责对效应酶的前体进行切割，产生有活性的效应 caspase；效应酶( caspase-3等)负责切割细胞核内、细胞质中的结构蛋白和调节蛋白，使其失活或活化，保证凋亡程序的正常进行。除了上述炎症和凋亡相关的功能，近年的证据显示 caspase家族成员还参与了细胞自噬、坏死、分化等生命活动的调控。
- caspase在细胞凋亡中的作用机制
不论起始 caspase或效应 caspase，通常均以无活性的酶原形式存在于细胞质中。接受凋亡信号刺激后，酶原分子在特异的天冬氨酸位点被切割，产生的两段多肽形成大小两个亚基，再聚合成异二聚体，此即具有活性的酶(图15-8A)。起始 caspase的活化属于同源活化(homo- activation)，即同一种酶原分子彼此结合或与接头蛋白结合形成复合物，在复合物中构象改变而活化进而彼此切割产生有活性的异二聚体。起始 caspase中，
caspase8和 caspase10含有串联重复的死亡效应结构域death effector domain， DED)， if caspase-2 FA caspase-9则含有 caspase募集结构域(caspase recruitment domain， CARD)。这两种结构域也存在于一些负责传递凋亡信号的接头蛋白分子结构中，通过结构域之间的聚合，caspase能够彼此结合或与接头蛋白结合，被招募到上游信号复合物中发生同源活化(图15-8A)。
效应 caspase的活化属于异源活化(heeo activation)。已活化的起始 caspase招募效应 caspase酶原分子后，对其进行切割，产生活性的效应 caspase(图15-8A)。效应 caspase负责切割细胞中的结构蛋白和调节蛋白，使其失活或活化，此时细胞进入凋亡的执行阶段。
目前已知的效应 caspase底物约280种，可以分为被活化和被失活两大类。 caspase对于这些底物的切割使得细胞呈现出凋亡的一系列形态学和分子生物学特征。被 caspase活化的代表分子是 caspase激活的DNA内切酶( caspase activated DNase，CAD)。CAD一般与其抑制因子ICAD( inhibitor of CAD)结合在一起，处于失活状态。细胞启动凋亡程序后，活化的 caspase-3降解LCAD，使有活性的CAD释放出来，在核小体间切割DNA，形成间隔200bp的DNA片段。因此，提取凋亡细胞的DNA进行琼脂糖凝胶电泳时会观察到DNA梯状条带( DNA ladder)(图15-9)，这是细胞凋亡的标志之一。另一个 caspase的重要底物是聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶[poly(ADP- ribose) polymerase， PARP J。PARP能够识别损伤的DNA，使组蛋白发生ADP-核糖基化，从DNA上脱离下来，有助于修复蛋白与DNA结合进行损伤修复，因此被认为是DNA损伤的感受器。在凋亡过程中PARP被 caspase切割后失活，使细胞对DNA的降解不再敏感。效应 caspase还通过切割细胞骨架蛋白使细胞的骨架体系发生结构变化，便于细胞改变形态以及形成凋亡小体等。例如通过切割核纤层蛋白使核纤层解聚，导致核膜收缩；切割核孔蛋白以及细胞质骨架蛋白，使细胞核与细胞质的信号传递中断。此外，黏着斑激酶( focal adhesion kinase，FAK)参与黏着斑形成和调节，是整联蛋白介导的信号转导中的重要成员，它同样也是效应 caspase的底物，FAK被切割失活导致调亡细胞与胞外基质以及其它细胞解离。
起始 caspase和效应 caspase组成细胞内凋亡信号的级联分子网络(图15-8B)，凋亡程序一旦启动，级联网络“顶端”的起始 caspase首先活化，切割下游caspase酶原，使得凋亡信号在短时间内迅速放大并传递到整个细胞，产生凋亡效应。这一过程是不可逆转的。
由于 caspase在细胞凋亡途径中发挥关键作用，可将其作为药物设计的靶标分子来对凋亡相关疾病进行控制。在动物模型中， caspase的抑制剂已被证实对细胞过度凋亡引发的疾病有疗效，例如可以降低急性心脏和肝脏损伤时的损伤度。另一方面，选择性地激活caspase或降低其活化的能障，可用于治疗癌症，例如将肿瘤细胞胞内或胞外的特异性蛋白与 caspase连接形成融合蛋白，通过特异性蛋白的聚合作用引发 caspase的活化，从而选择性杀死肿瘤细胞；或者将肿瘤细胞中失活的 caspase替换成活性形式，用RNA干扰降低肿瘤细胞中 caspase抑制因子的表达等方法，促进肿瘤细胞的凋亡。
3.细胞凋亡信号通路
细胞内外的凋亡信号主要通过两条通路诱导caspase活化，引发细胞凋亡：由死亡受体( death receptor)引发的外源途径和由线粒体引发的内源途径(图15-10)。
死亡受体引发的凋亡起始于死亡配体与受体的结合。死亡配体主要是肿瘤坏死因子家族成员，包括TNF、Fas配体( Fas ligand)、 TRAIL等。它们的受体包括TNFR1、Fas、DR-4、DR-5等。死亡受体的胞质部分均含有死亡结构域( death domain，DD)，负责招募凋亡信号通路中的接头蛋白。Fas是死亡受体家族中的代表成员。Fas配体与之结合后引起Fas的聚合，聚合后的Fas通过死亡结构域招募接头蛋白FADD和 caspase-8酶原，形成死亡诱导信号复合物( death inducing signaling complex，DISC)(图15-10)。 caspase-8酶原在复合物中通过自身切割(同源活化)而被激活，进而切割效应caspase： caspase 3酶原，产生有活性的caspase3，导致细胞凋亡。另一方面，活化的 caspase-8还通过切割信号分子Bid将凋亡信号传递到线粒体，引发凋亡的内源途径，使凋亡信号进一步扩大。通过以上途径，分泌Fas配体的杀伤性T淋巴细胞可以诱导被病原体感染的靶细胞发生凋亡，而被损伤的细胞可以通过自己产生Fas配体和Fas，触发自身的凋亡。
在凋亡的内源途径中，线粒体处于中心地位。当细胞受到内部凋亡信号(如不可修复的DNA损伤)刺激时，线粒体膜通透性会发生改变，向细胞质中释放出凋亡相关因子，引发细胞凋亡。线粒体释放到胞质中的凋亡因子有多种，其中最“著名”的是细胞色素c。1996年王晓东领导的研究团队发现，在HeLa细胞提取物中加入ATP能够诱发外源细胞核DNA断裂。他们将HeLa细胞提取物经过柱层析后分为两种组分流出组分和吸附组分，并发现这两种组分只有合并起来才能诱导凋亡。他们进而对吸附组分进行了分级纯化，最终发现分子质量为15kDa的蛋白质是凋亡的必需因子。出乎大家的预料，序列测定结果表明这一蛋白质是线粒体电子传递链的组分细胞色素c。紧接着，他们从流出组分中分离克隆到了另外两个凋亡的必需因子APAF1(apoptosis protease activating factor 1) FA caspase-9， A而建立了细胞凋亡内源途径的模型(图15-10)。细胞接受内源性凋亡信号刺激后，细胞色素c从线粒体释放到细胞质中与APAF1结合。APAF1是线虫凋亡分子Ced4在哺乳动物细胞中的同源蛋白，分子质量为130kDa，N端含有 caspase募集结构域(CARD)。它与细胞色素c结合后发生自身聚合，形成一个很大的复合物，称为凋亡复合体( apoptosome)(图15-10)，分子质量约为700~1400kDa。之后，APAF1通过CARD结构域招募细胞质中的 caspase-9酶原， caspase-9酶原在凋亡复合体中发生同源活化，活化的 caspase9再进一步切割并激活 caspase-3和 caspase-7酶原，引发细胞凋亡。
细胞调亡的内源途径中，细胞色素c的释放是关键步骤，源于线粒体膜通透性的改变，主要受到Bcl2(the B- cell lymphoma gene2)蛋白家族的调控。Bc12是线虫凋亡抑制分子Ced9在哺乳动物中的同源分子，家族成员大多定位在线粒体外膜上，或受信号刺激后转移到线粒体外膜上。按照功能，可将Bcl2家族成员分为3个亚族：Bcl2亚族，包括Bcl2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcll等，对细胞凋亡发挥抑制作用；Bax亚族，包括Bax
Bak、Bok，功能与Bc12亚家族相反，促进细胞凋亡；BH3亚族，包括Bad、Bi、Bik、Puma、Noxa等，它们能够充当细胞内调亡信号的“感受器”，作用也是促进细胞凋亡。Bc12家族成员可以通过彼此间的聚合及解聚来调节线粒体的通透性。细胞接受内源的凋亡信号后，Bax亚族的促凋亡因子Bax和Bak发生寡聚化，从细胞质中转移到线粒体外膜上，并与膜上的电压依赖性阴离子通道(volt voltage-dependent anion channel， VDAC)
相互作用，使通道开放到足以使线粒体内的凋亡因子如细胞色素c等释放到细胞质中，引发细胞凋亡。正常状态下Bc12与Bax/Bak形成复合体，阻碍Bax和Bak的寡聚化，防止线粒体膜通道的开启；而BH3亚族成员如Bid被活化后又可以解除Bc2对Bax/Bak的抑制。
上述两种看似迴异的 caspase依赖性细胞凋亡途径亦有相似之处。即起始 caspase如 caspase8、 caspase-9等，均在一些大的多成分复合物中被活化，如DISC、apoptosome等。在复合物的形成过程中，多种接头蛋白如FAD、APAF等发挥了关键作用，它们负责引导起始 caspase进入复合物的适当位置，进而使之发生同源活化。
细胞凋亡的外源途径和内源途径彼此关联。当caspase-8通过外源途径被活化后，能够切割BH3亚族成员Bid使其活化，被激活的Bid从细胞质转移到线粒体，释放出被Bcl2束缚的 Bax/Bak，活化内源途径，从而放大外源凋亡信号的效应(图15-10)；另一方面，凋亡的内源途径被激活后，线粒体释放的促凋亡因子Smac(见后文)也能够活化 caspase8，从而与外源途径交汇。
研究表明当使用 caspase的抑制剂，或者将 caspase敲除之后，一些细胞仍然可以发生凋亡。线粒体在其中同样发挥了关键作用。除了细胞色素c，线粒体能够向细胞质内释放多个凋亡相关因子，如凋亡诱导因子( apoptosis inducing factor，AIF)，限制性内切核酸酶G( endonuclease G， Endo g)，它们从线粒体中释放出来进入细胞核，对核DNA进行切割，引发 caspase非依赖性细胞凋亡( caspase independent apoptosis(图15-10)。
不论是 caspase依赖性还是非依赖性的细胞凋亡都会归结到最终阶段：凋亡细胞的清除。凋亡细胞形成的凋亡小体可迅速被周围细胞或巨噬细胞等专职吞噬细胞识别并吞噬。凋亡细胞表面具有引发吞噬作用的信号分子，如磷脂酰丝氨酸( phosphatidylserine)。它一般存在于正常细胞膜脂双层的内叶，细胞发生凋亡时外翻定位到脂双层外叶，向吞噬细胞发出“吃掉我”的信号。
磷脂酰丝氨酸的细胞表面定位也是凋亡的标志之一。
4.生死抉择：细胞凋亡的调控
生物体是高度有序的细胞群体，细胞的生存、增殖和死亡都受到严格的信号控制。大多数细胞都需要获得存活信号来维持生存，这类信号主要来自于其它细胞分泌的细胞因子，包括多种有丝分裂原和生长因子。如果细胞接受不到足够的存活信号，就会激活自杀程序，这种依赖性保证了细胞仅生存于适当的时间和地点。例如发育过程中神经细胞的存活依赖靶细胞分泌的神经生长因子，神经生长因子与神经细胞表面的受体结合后，激活PI3K途径，活化了蛋白激酶PKB，活化的PKB磷酸化Bc2家族BH3亚族成员Bad，Bad能够抑制Bcl2促进细胞凋亡，被磷酸化后Bad失去活性，导致Bcl2持续抑制Bax/Bak，神经细胞不会发生凋亡。而接受不到足够生长因子的多余神经元，Bcl2的保护作用被解除，凋亡后使得神经细胞的数量与靶细胞匹配。此外，多种细胞存活及生长必需的细胞因子，还能通过激活NFKB等转录因子，增加凋亡抑制因子的表达量来抑制细胞凋亡(图15-11)。
作为细胞凋亡的核心分子， caspase本身的活性在细胞中也受到严格调控，以保证在必需的情况下凋亡程序才能启动。细胞中存在一类 caspase抑制因子( inhibitor of apoptosis，cIAP)，能够直接与 caspase活性分子结合，阻抑其对底物的切割。而当凋亡程序启动后，有两种蛋白质与细胞色素c一起从线粒体中释放出来：其一是Smac( second mitochondria derived activator of caspase)， X WR DIABLo(direct IAP binding protein with low pl)。该蛋白含有IAP结合结构域，通常情况下存在于线粒体的膜间隙中。它从线粒体释放出来后能与cAP结合，释放出被封闭的 caspase。其二是丝氨酸蛋白酶Htra2Omi，接受凋亡信号后从线粒体释放出来，通过切割cIAP解除其抑制凋亡的作用。对细胞色素c和Smac的双重需要确保了 caspase级联反应仅在信号充分的情况下才被活化。
病毒为了保证能在细胞中顺利复制，也演化出相应的对抗机制来抑制 caspase的活性，阻止宿主细胞发生凋亡，如天花病毒蛋白CmA和杆病毒蛋白p35就是天然的 caspase抑制剂，疱疹病毒和痘病毒携带 caspase抑制因子v-FLP，可与死亡受体Fas的接头蛋白FADD发生相互作用，通过抑制调亡的外源途径来抑制宿主细胞的凋亡。
线粒体获得的促凋亡信号往往来自于细胞内的转录因子p53。p53是重要的肿瘤抑制基因，如上节所述可以通过阻断细胞周期引发细胞复制衰老，而p53的活化也能诱导细胞凋亡。在p53依赖性的细胞凋亡过程中，p53能够直接解除Bc2对Bax/Bak的抑制作用触发凋亡内源途径；或者发挥转录因子的功效，激活凋亡正调节因子，抑制负调节因子的表达来促进凋亡。p53的活性对癌的放射和化学疗法的效果起关键作用。具有p53基因野生型拷贝的肿瘤，如睾丸癌和儿童急性淋巴母细胞白血病等，对放疗和化疗诱导的细胞凋亡较为敏感；而缺少功能性p53基因的肿瘤，如黑色素瘤、结肠癌、前列腺癌和胰腺癌等通常不能被诱发凋亡，对放疗和化疗具有抵抗性。
哺乳动物细胞中抗凋亡和促凋亡的调控因子多种多样，因此细胞的命运—生存或者死亡，可能取决于细胞中这两类调控因子的相对含量以及胞外信号对它们进行活性调控的综合效应。
三、细胞程序性坏死的分子机制
被称为“ necroptosis”的细胞程序性坏死。在TNF和某些病原体的诱导下，蛋白激酶RPK3及其上游信号分子会聚合形成坏死复合物( necrosome)，RPK3在复合物中发生磷酸化而活化，进而招募并磷酸化下游分子MLKL( mixed- lineage kinase domain-like)。MLKL被RPK3磷酸化后发生寡聚化，通过与质膜中的磷脂酰肌醇磷酸( phosphatidylinositol phosphate，PP)结合，在细胞膜上形成通道，导致细胞膜屏障作用消失，细胞坏死。RIPK3在 necroptosis信号通路中起决定作用，它在不同类型细胞中表达量不同，仅当RIPK3蛋白含量足够时细胞才会被诱导发生necroptosis。
另一种伴随炎性因子大量释放的程序性坏死，即细胞焦亡的分子机制最近也取得了重要进展。如前所述，caspase家族包括十多个成员，其中大部分在凋亡过程中发挥作用，而 caspase-1和 caspase-4/5/1l则参与炎症信号通路。 caspase-1的功能主要是在特异位点切割炎性因子的前体蛋白po1β和pro-18，产生具有活性的IL1和18。与其他 caspase类似， caspase-l通常以无活性的前体形式存在，需要聚合后发生切割才被活化，这一过程依赖于细胞内称为炎性小体( inflammasome)的蛋白复合体。当病原体入侵到细胞内部，一系列蛋白质包括感知信号的受体、接头蛋白、 caspase-1前体等会组装形成炎性小体，促使其中的 caspase-1前体发生同源活化(见前文)，切割pro1β和pro18，使之成熟并分泌到胞外，诱导机体发生炎症。20世纪80年代研究者发现了依赖 caspase-1活化、伴随Ⅱ1β大量释放的细胞死亡现象，但其机制一直不明了。2015年发现GSDM( gasdermin)家族成员 GSDMD( gasdermin D)可能是细胞焦亡重要的执行分子。免疫细胞、消化道上皮细胞中的 GSDMD通常处于自抑制构象。病原体侵染导致 caspase-1经由炎性小体被活化，而 caspase-45/1l可以与病原体成分如细菌脂多糖直接结合而被诱导活化，以上活化的炎性 caspase切割 GSDMD分子中部的特异位点，产生N端片段，迁移到细胞膜，聚合形成直径为10~20mm的质膜孔洞，为I1B释放提供通道，同时可能导致钠离子伴随大量水分子内流，细胞膨胀破裂死亡。
与我们熟知的细胞凋亡相比，细胞程序性坏死在形态特征界定、分子机制等方面尚存诸多料学问题待解决。
四、植物细胞程序性死亡的分子机制
近年来发现了众多在植物细胞程序性死亡过程中发挥作用的信号分子，包括各种转录因子、激酶、核酸酶、蛋白酶、膜泡运输蛋白等。这些分子彼此间的上下游关系以及信号网络仍不够清晰，还需要确认它们在不同植物种类间功能的保守性。现有植物基因组中未发现动物 caspase的同家族成员，但植物有一类蛋白酶称为metacaspase，在植物细胞程序性死亡信号途径中发挥作用。 metacaspase与动物 caspase具有类似的酶活性中心，都含有半胱氨酸残基；它们与动物 caspase切割底物的位点不同，切割精氨酸或赖氨酸形成的肽键。例如液泡膜破裂型的程序性死亡源于液泡酶PE( vacuolar enzyme)的活化，VPE具有 caspase-1的类似活性中心；液泡膜与细胞膜融合型的程序性死亡源于膜融合的抑制蛋白被蛋白酶体降解了，而参与这一过程的蛋白酶体成分之一PBA1具有 caspase-3的类似活性中心。
由基因控制的程序性死亡不仅存在于动物、植物等多细胞生物，单细胞生物如细菌和酵母也存在程序性死亡。越来越多的实验证据表明，细胞程序性死亡机制在细胞生命的演化过程中具有共同的起源。而不同物种研究体系的建立，将有助于揭示各种程序性死亡途径之间的复杂关系。
本章介绍了细胞两种重要的生命活动：细胞衰老和细胞程序性死亡。它们被细胞内外危机信号引发，可以视为细胞的“应激”反应，并且均由细胞内精密信号通路控制。可以预见，将发现更多由不同分子介导的、不同形式的细胞衰老和程序性死亡方式，在各种生理病理状态下发挥功能。另一方面，现在发现相同的信号如DNA损伤既可以诱导细胞衰老，又可以触发细胞凋亡；TNF刺激可以诱发细胞凋亡和细胞坏死两种方式的程序性死亡；而一些胞内信号传递分子如p53、RIP1为多条信号通路共享。由此可见在不同的细胞程序性死亡途径之间，乃至细胞衰老和凋亡程序之间均存在广泛的“交叉对话”，细胞如何应对不同的危机信号，如何在各种程序性死亡以及细胞衰老的命运间进行抉择，有待研究者们深入解析。
