第1节 重组DNA技术的基本工具

“工欲善其事，必先利其器"。在培育转基因番木瓜时，首先要在体外对含有所需要基因的DNA分子进行“切割”、改造和“拼接"；然后，将重组DNA分子导入番木瓜体细胞内，并使其在细胞中表达。实现这一精确的操作过程至少需要三种“分子工具”，即准确切割DNA分子的“分子手术刀”、将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”和将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”。科学家正是靠这三种必需的工具（图3-1),才使培育转基因番木瓜这一奇妙构想变成了现实。

限制性内切核酸酶——“分子手木刀”

切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶（restriction endonuclease），又称限制酶（restriction enzyme）。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。迄今分离的限制酶有数千种，许多已经被商业化生产。它们能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键（图3-2）断开。

大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。例如，EcoR I、Sma I限制酶的识别序列均为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端（图3-3）。当限制酶在它识别序列的中心轴线（图中虚线）两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。

DNA连接酶——“分子缝合针”

将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA连接酶来完成的。1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够将两个DNA片段连接起来的酶，称之为DNA连接酶（DNA ligase）。在基因工程操作中，常用的DNA连接酶主要有两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E.coli DNA连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4 DNA连接酶。这两类酶都能将双链DNA片段“缝合"起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，但这两种酶的作用有所差别。E.coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段。而T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低。

基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

怎样才能将外源基因送入细胞呢？通常是利用质粒（plasmid）作为载体（vector），将基因送入细胞。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。这些质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选（图3-4）。

在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。这些基因工程载体，相当于一种运输工具，因此将它们比喻为“分子运输车”。

探究实践 DNA的粗提取与鉴定

DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCI溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。

目的要求

1. 了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。
2. 学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。

材料用具

1. 材料：新鲜洋葱（也可以选择香蕉、菠菜、菜花和猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同）、研磨液、体积分数为95％的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。研磨液和二苯胺试剂的配制方法参见本书附录2。
2. 用具：烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。

方法步骤

1. 称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
2. 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r／min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
3. 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95％），静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10 000 r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
4. 取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。

（添加：注意，此处可以先用二苯胺检验是否是DNA，然后再继续粗提取，如果一开始实验错误得到的不是DNA，后面的工作都是浪费。）

结果分析与评价

1. 你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
2. 你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
3. 与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。

进一步探究

本实验只是对DNA进行了粗提取，请查阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。